Une sérine protéase cytotoxique putative de Salmonella typhimurium UcB5 récupérée à partir d'un hamburger insuffisamment cuit

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3926 (2023) Citer cet article

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Une exoprotéase de virulence putative désignée UcB5 a été purifiée avec succès à partir de la bactérie Salmonella typhimurium jusqu'à l'homogénéité électrophorétique avec une récupération de 13,2 fois et 17,1 % par chromatographie hydrophobe, échangeuse d'ions et par perméation de gel à l'aide de phényl-sépharose 6FF, DEAE-sépharose CL-6B , et Sephadex G-75, respectivement. En appliquant SDS-PAGE, le poids moléculaire a été confirmé à 35 kDa. La température, le pH et le point isoélectrique optimaux étaient de 35 °C, 8,0, 5,6 ± 0,2, respectivement. UcB5 s'est avéré avoir une large spécificité de substrat contre presque tous les substrats chromogéniques testés avec une affinité maximale contre N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA atteignant Km de 0,16 mM, Kcat/Km de 3,01 × 105 S−1 M -1 et une activité amidolytique de 28,9 µmol min-1 L-1. Il a été considérablement inhibé par le TLCK, le PMSF, le SBTI et l'aprotinine, tandis que le DTT, le β-mercaptoéthanol, la 2,2′-bipyridine, l'o-phénanthroline, l'EDTA et l'EGTA n'ont eu aucun effet, ce qui suggère un type de sérine protéase. En outre, il a montré une large spécificité de substrat contre une large gamme de protéines naturelles, y compris les protéines sériques. Une étude de cytotoxicité et de microscopie électronique a révélé que l'UcB5 pouvait provoquer une protéolyse subcellulaire qui a finalement conduit à une nécrose du foie. Pour cela, les recherches futures devraient se concentrer sur l'utilisation d'une combinaison d'antiprotéases externes et d'agents antimicrobiens pour le traitement des maladies microbiennes au lieu d'utiliser des médicaments seuls.

Les toxines et les enzymes agissent comme des agents de virulence clés dans la pathogenèse microbienne à l'intérieur des hôtes malades1,2. Les toxines bactériennes sont entièrement caractérisées et leur rôle dans le processus de pathogenèse est bien étudié, alors que le rôle des protéases microbiennes dans la pathogenèse des animaux et des plantes n'est pas bien étudié. Cela pourrait être le résultat de la complexité des enzymes et du manque de sélectivité par rapport aux toxines3. Les protéases ont été identifiées depuis longtemps dans les extraits cellulaires de nombreuses bactéries pathogènes4. Il peut être surprenant d'apprendre que la majorité d'entre eux n'ont pas été identifiés pendant longtemps et n'ont été définis que récemment. Les microbes produisent de nombreux types de protéases classées en types sérine, métallo, aspartique et cystéine. Certains d'entre eux sont spécifiquement inhibés par des inhibiteurs de protéases plasmatiques connus sous le nom de serpines, tandis que la plupart d'entre eux sont résistants ou inactivent les antiprotéases plasmatiques humaines. Par conséquent, une fois à l'intérieur, ceux-ci accéléreront le traitement de la maladie et l'altération de l'hôte5.

Leur implication dans la virulence a été liée à une variété de méthodes. Pour commencer le processus d'invasion ou digérer les protéines de l'hôte pour accéder aux nutriments peptidiques, elles protéolysent et détruisent d'abord les tissus de l'hôte. Par exemple, en interférant avec les protéines de signalisation cellulaire ou les protéines de protéolyse des composants de la matrice, la protéase HtrA facilite d'abord la propagation des maladies. Deuxièmement, ils peuvent activer les toxines des sous-unités (toxines AB) en séparant la fraction active (sous-unité A) de la fraction de liaison (sous-unité B). Troisièmement, certaines d'entre elles, telles que les protéases Clp et Lon, agissent à l'intérieur du cytosol directement en détruisant au bon moment les contrôleurs de virulence et indirectement en offrant une résistance aux composants antagonistes intérieurs tels que les superoxydes et les radicaux libres pour arrêter les composants effecteurs immunitaires de l'hôte contre l'infection. pathogène bactérien6.

S. enterica avec plus de 2000 sérovars peut causer de nombreuses maladies différentes. Les sérovars Enteritidis et Typhimurium sont la cause la plus fréquente de gastro-entérite chez l'homme, tandis que d'autres sérovars comme S. typhi sont la cause fondamentale de maladies systémiques mortelles. Fait intéressant, les mutants du sérovar Typhimurium dépourvus de protéases clpP ou clpX se sont avérés être des souches non virulentes indiquant l'importance de la protéase ClpXP dans la salmonellose7. De plus, les mutants de sérotypes dépourvus de protéase Lon sont très sensibles au H2O2 et à l'acidité, donc incapables de persister à l'intérieur des macrophages et de proliférer dans les parties distales du corps pour initier des maladies8. Il a été constaté que la peptidase N du sérovar Typhimurium est la principale aminopeptidase à l'intérieur des cytosols avec une large gamme d'activité de substrat9.

À l'heure actuelle, les infections causées par les sérovars de Salmonella restent dangereuses, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire où ils peuvent être consommés avec de nombreux aliments contaminés et entraîner des conditions pathologiques locales à l'intérieur du tube digestif, qui peuvent se propager dans un infection systémique10. Malheureusement, la caractérisation détaillée des protéases de Salmonella fait défaut, par conséquent, nous avions principalement l'intention de surveiller les activités protéolytiques et hémolytiques des isolats de Salmonella et de Shigella accompagnant des échantillons d'aliments locaux. L'objectif de cette partie de la recherche a été élargi pour révéler les caractéristiques enzymatiques et les altérations cellulaires des cellules de mammifères dues à la protéase UcB5 produite par l'isolat le plus puissant, S. typhimurium.

DTT, SBTI et EAM ont été obtenus auprès de Merck (Pékin, Chine). La fibrine, le fibrinogène, le pNA, le PMSF, le DMSO, l'EGTA, le PHMB, la leupeptine et la pepstatine A ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (MO, USA). Substrats synthétiques chromogéniques tels que D-Val-Leu-Arg-pNA (V6258), D-Val-Leu-Lys-pNA (V7127), D-Phe-Pip-Arg-pNA (P7027) et N-Succ-Ala -Ala-Pro-Phe-pNA (S7388) ont également été achetés auprès de Sigma-Aldrich. La lignée cellulaire d'adénocarcinome humain HT29 a été achetée chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Le Phényl-Sepharose 6FF, le DEAE-Sepharose CL-6B, le Sephadex G-75 et les protéines marqueurs ont été achetés auprès d'Amersham Biosciences (Suède). Le reste des produits chimiques était de qualité analytique provenant de fournisseurs résidents.

La souche bactérienne à l'étude a été initialement récupérée à partir d'un échantillon de burger de bœuf insuffisamment cuit qui a été acheté sur un marché traditionnel local. Cette souche a montré l'activité protéolytique et hémolytique la plus élevée parmi un total de quatorze isolats bactériens récupérés à partir de divers échantillons d'aliments, y compris des viandes transformées et des produits laitiers. L'isolement différentiel de ces bactéries a été réalisé sur des plaques de gélose Salmonella-Shigella (SS) (Himedia, Inde) additionnées de lait écrémé à 1 % à pH 7,0. Ensuite, les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 48 h. Les halos dégagés entourant les colonies indiquent une activité protéolytique. Pour le dépistage de l'activité hémolytique, une gélose SS additionnée de 10 % de sang de mouton citraté a été utilisée. Les zones de halo entourant les colonies bactériennes étaient indicatives d'une activité hémolytique. Sur la base de ce programme de dépistage, l'isolat numéro cinq qui a été isolé à partir d'un échantillon de burger de bœuf insuffisamment cuit a été sélectionné et identifié au niveau de l'espèce à l'aide de l'empreinte génétique 16SrDNA et a exécuté une analyse BLAST sur la base de données GenBank. Les cultures bactériennes à court terme ont été conservées sur de la gélose nutritive à 4 ° C, tandis que les cultures à long terme ont été conservées à - 80 ° C dans un bouillon glycériné à 20% (v / v).

Les inoculums de la souche numéro UcB5 ont été régulièrement sous-cultivés dans un bouillon LB constitué de (g/L) de NaCl 5,0, d'extrait de levure 5,0 et de tryptone 10,0 à pH 7,0. Exactement, un pour cent (v/v) d'inoculum de 12 h (~ 3 × 108 cfu/mL) a été transporté dans le bouillon de fermentation à pH 7,0. Le milieu de base consistait en (p/v) 1 % de fructose, 0,5 % de NaCl, 0,5 % de peptone, 0,15 % de MgSO4·7H2O, 0,08 % de KH2PO4, 0,02 % de K2HPO4, 0,005 % de CuSO4 et 0,001 % de FeSO4. L'incubation a été effectuée à une vitesse d'agitation de 150 tours par minute à 37 ° C pendant 48 h dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de bouillon.

L'activité protéolytique a été évaluée en mélangeant 1 ml de surnageant de culture et 1 ml de solution d'azocaséine à 1 % (p/v) dissoute dans un tampon Tris-HCl 0,2 M de pH 7,0. La réaction enzyme-substrat a été laissée se dérouler pendant 30 min à 37 ° C et a été terminée par l'ajout de 2 ml d'une solution d'acide trichloroacétique à 10% (p/v). Ensuite, incubation pendant 60 min dans un bain de glace pilée. La quantité de protéines de dégradation solubles (C) a été mesurée (mg/mL) suite à ce calcul ; Cmax (mg/mL) = 1,55 DO280 − 0,76 DO260. Une unité (1 U) d'activité enzymatique protéolytique était équivalente à un microgramme de l-tyrosine libérée par millilitre par minute de réaction dans les conditions standard d'expérimentation.

La protéase brute a été purifiée sous refroidissement à 4 ° C en quatre étapes comprenant la précipitation du sel (NH4) 2SO4, la chromatographie hydrophobe Phenyl-Sepharose 6FF, la chromatographie d'échange d'anions DEAE-Sepharose CL-6B et la chromatographie par perméation de gel Sephadex G-75. Initialement, le bouillon de culture a été centrifugé à 7000 × g pendant 10 min, puis l'ajout de (NH4) 2SO4 à 30–70% de saturation a été effectué. Centrifugation à une vitesse de 10 000 xg pendant 15 min pour récolter les protéines solubles. La protéase brute culottée et d'autres protéines ont ensuite été remises en suspension à pH 7,8 dans du tampon A (Tris-HCl 20 mM comprenant 1,0 M )NH4)2SO4. Après l'élimination des matières en suspension et l'étape de dialyse, la protéase brute concentrée a été chargée dans une colonne Phenyl Sepharose 6 FF de dimension 1,5 × 20 cm2. Par la suite, une ascension linéaire de 0,5 à 0,0 M (NH4) 2SO4 dans le tampon A a été appliquée pour l'élution des protéines. A partir de ce chromatogramme d'élution, les fractions actives présentant une activité enzymatique ont été regroupées et concentrées. De là, chargé sur la colonne suivante comprenant du DEAE-Sepharose CL-6B avec une dimension de 1,5 x 15 cm2. L'élution a été effectuée à un débit de 0, 5 ml / min à pH 9, 4 avec un tampon Tris – HCl 20 mM (tampon B). Les fractions actives présentant une activité protéolytique ont ensuite été concentrées, dialysées avec du tampon B et chargées dans la colonne suivante comprenant Sephadex G-75 FF avec une dimension de 1,5 × 30 cm2. L'élution a été effectuée par le tampon A. Les fractions finales actives de protéase ont été lyophilisées et SDS-PAGE a été réalisée par la technique universelle de Laemmli11 en utilisant un gel de séparation à 15 % (p/v) et un gel d'empilement à 5 % (p/v).

L'impact de la température sur l'activité enzymatique a été examiné à 20–65 °C en utilisant 1 % (p/v) d'azocaséine dans un tampon Tris–HCl 0,2 M, pH 7,0. D'autre part, pour étudier la stabilité thermique, une solution de protéase testée dans du Tris-HCl 0,2 M (pH 7,0) a été laissée au repos entre 20 et 65 °C pendant 60 min. À la fin de l'incubation, les traitements ont ensuite été refroidis pour la détermination de l'activité protéase restante dans les réglages typiques du dosage enzymatique.

Pour étudier l'impact du pH sur l'activité protéolytique de UcB5, les solutions réactionnelles ont été fixées à une large gamme de pH par trois tampons. Tampon citrate-phosphate pour atteindre une plage de pH de 3,0 à 6,0, tampon Tris-HCl pour des pH compris entre 7,0 et 8,0 et tampon glycine-NaOH pour ajuster les pH dans la plage de 9,0 à 13,0. L'azocaséine à une concentration de 1 % (p/v) a été utilisée et l'incubation des réactions enzyme-substrat a été effectuée à 35 °C.

Pour étudier la stabilité du pH de l'enzyme pure, elle a été incubée pendant 60 min à 35 ° C avec différents pH compris entre 5,0 et 13,0 en utilisant les tampons prescrits. L'activité enzymatique restante a été évaluée à pH 8,0. De plus, le point isoélectrique de la protéase testée a été déterminé par incubation pendant une nuit d'une préparation concentrée de l'enzyme pure à des pH compris entre 3,0 et 11,0 à 4 °C. La précipitation des protéines a été effectuée à la force gravitationnelle de 10 000 × g pendant 15 min. Les pastilles de protéines ont été quantifiées selon la méthode de Bradford12. Le point isoélectrique a été exprimé en degré de pH où la précipitation maximale des protéines a été effectuée13.

Ceux-ci ont été déterminés colorimétriquement contre plusieurs peptides chromogéniques en tant que substrats synthétiques tels que P7021, V7127, S7388 et V6258. Pour l'expérimentation, chaque puits d'une microplaque a été chargé avec 5 µl de solution enzymatique dans un tampon Tris – HCl 20 mM (pH 8,0) et 100 µl d'un substrat synthétique à une concentration spécifique de 0,02 à 0,15 mM. La réaction a été effectuée à 37°C et terminée à des intervalles de temps par l'addition de 1,4 ml d'acide trichloroacétique 0,15 M. La quantité de pNA libérée a été estimée par spectrophotométrie à A405 nm. Une unité (1 U) d'activité amidolytique de la protéase a été calibrée en nmol du substrat chromogénique dégradé par min par ml en raison de l'action de la protéase testée. Les paramètres cinétiques ont été estimés à partir des tracés de Lineweaver-Burk en fonction de la vitesse initiale de la réaction enzymatique.

Pour définir le groupe auquel appartient l'UcB5 purifié, l'influence de divers ions métalliques et réactifs standards sur son activité amidolytique a été explorée. Dans une microplaque, ceux-ci ont été mélangés avec 1,0 × 10–4 mg du substrat chromogène S7388 et 2,0 × 10–3 mg de l'enzyme dans 100 µl de tampon Tris–HCl 20 mM (pH 8,0) et incubés pendant 3 min à 37 °C. Le pNA libéré a été quantifié par la mesure spectrophotométrique à A405.

Pour l'expérimentation des ions métalliques, ils ont été testés dans des tests parallèles à la concentration de 5 mM. Les concentrations appliquées de réactifs protéases variaient selon la littérature citée (voir les résultats). L'activité enzymatique dans le traitement dépourvu de réactifs et de cations a été considérée comme 100 %.

La spécificité de substrat d'UcB5 contre des substrats protéiques naturels a été étudiée à une concentration de 0,5 % (p/v) selon la procédure de Peng et al.14. Ceux-ci comprennent la caséine, l'élastine, l'hémoglobine, la fibrine, la gélatine, le fibrinogène, le collagène, la mucine, les IgG et l'albumine sérique. Ceci a été déterminé contre plusieurs protéines naturelles. Une unité (1 U) d'activité protéolytique a été calibrée comme la quantité d'enzyme qui libère la comparable à 1 umol de l'acide aminé tyrosine par millilitre par minute dans les conditions standard de l'essai.

Les expériences suivantes ont été approuvées par une institution appropriée. En plus de cela, toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes, y compris les directives ARRIVE. L'activité anticoagulante in vitro a été examinée comme l'augmentation de la période de coagulation du sérum sanguin humain en présence de 15 ug de protéase UcB5/ml15. Exactement, 100 µl de sérum sanguin ont été vortexés avec des volumes équivalents de chaque thromboplastine et kaolin. Après 2 min d'incubation à 37 °C dans un bain-marie, exactement 100 µl de CaCl2 à 0,3 % (p/v) et 100 µl de l'enzyme ont été ajoutés. Le temps de coagulation en présence de l'enzyme a ensuite été déterminé par comparaison avec des blancs contenant une quantité équivalente de sérum physiologique à la place de l'enzyme purifiée.

Le test de cytotoxicité in vitro de la protéase purifiée de S. typhimurium contre la lignée cellulaire d'adénocarcinome humain HT29 (Merck, Darmstadt, Allemagne) a été réalisé sur une plaque à 96 puits par incubation pendant 24 h. Pour 1 × 105 cellules HT29 par millilitre, quinze microgrammes de l'enzyme ont été utilisés. À la fin de l'incubation, le pourcentage de mort cellulaire de HT29 a été évalué par le test MTT standard16. Pour les blancs négatifs, une solution saline physiologique a été utilisée à la place des préparations de protéases actives, tandis que pour les blancs, un milieu sans cellules a été utilisé. L'idée de ce test est que les cellules survivantes restantes peuvent convertir le réactif MTT tétrazolium jaune en complexe formazan violet avec une absorption caractéristique à A540 nm, indiquant ainsi la viabilité de HT29. L'intensité de la couleur violette est en relation directe avec le nombre de cellules survivantes après exposition à l'UcB5.

En outre, un test d'activité endommageant les cellules contre les globules rouges (activité hémolytique) due à l'enzyme purifiée a été effectué. Ceci a été réalisé en vortexant des volumes identiques de 15 µg de protéase/mL et de 4 % (v/v) de globules rouges humains lavés en suspension dans un tampon borate 0,1 M, pH 7,5. L'incubation a été effectuée à 37 ° C pendant 90 min, puis la quantité d'hémoglobine libérée a été mesurée par colorimétrie. À titre de comparaison, un traitement d'hémolyse complet a été effectué en mélangeant une suspension de globules rouges avec une solution de triton X-100 à 1 % (v/v).

En outre, un criblage in vivo de l'activité endommageant les cellules a été effectué et la valeur LD50 a été calculée. Pour cela, des souris BALB/c pesant 22 à 25 g ont été acclimatées aux conditions de laboratoire pendant une semaine et maintenues dans des conditions nutritionnelles et physiques relativement fixes. Ils ont ensuite été répartis en six groupes de six par cage. Le premier groupe était représenté comme le groupe de blanc universel. Les souris de ce groupe ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec un volume égal d'une préparation enzymatique dénaturée par la chaleur à une concentration de 60 ug/poids corporel. Alors que les cinq autres groupes ont reçu une injection intraperitoneale de la préparation de protéase active à diverses concentrations (60, 30, 15, 8 et 4 ug de protéase/poids corporel) dans un volume total de 1 ml de solution. Les animaux ont ensuite été observés à des intervalles de temps tout au long de 48 h pour le calcul de la DL50 selon la méthode de Karber. Les foies des souris affectées et vierges ont été prélevés instantanément après la mort et fixés dans une solution de glutaraldéhyde à 5 % (v/v) puis à 1 % (p/v) d'OsO4. Avant la dissection d'une souris vierge, celle-ci a été anesthésiée par le gaz inhalant sévoflurane. Des coupes ultrafines de 70 nm ont été découpées par ultramicrotome RMC et chargées sur des grilles de support TEM de qualité standard constituées de cuivre pour examen sous JEOL 1010 TEM.

Toutes les mesures et tous les traitements ont été effectués en triple, sauf indication contraire. L'analyse statistique a été effectuée par le logiciel SPSS Statistics V24. Les lectures finales ont été représentées sous forme de moyennes ± écarts-types.

L'étude in vivo a été réalisée sous l'autorisation n° 5/2019EC du Comité d'éthique des soins aux animaux expérimentaux de l'Université Kafrelsheikh, en Égypte. En plus de cela, toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes, y compris les directives ARRIVE.

Au cours d'une enquête préliminaire sur les isolats de Salmonella et/ou de Shigella exerçant à la fois une activité protéolytique et hémolytique, nous avons isolé un total de quatorze isolats sur gélose SS additionnée de lait écrémé. Ceux-ci ont été obtenus à l'origine à partir de trente échantillons d'aliments collectés sur certains marchés locaux. Le producteur le plus puissant parmi eux était l'isolat numéro cinq qui a été isolé à partir d'un échantillon de burger de bœuf insuffisamment cuit. Par conséquent, il a été désigné comme souche UcB5. Les données de séquençage du gène 16SrDNA et l'analyse BLAST ont indiqué que la souche UcB5 était S. typhimurium avec une identité similaire à 98,86 % avec un genre et une espèce existants. La séquence nucléotidique a été répertoriée dans la GenBank Records Library sous le numéro d'accession (MH340533.1).

La croissance bactérienne et la production de protéase UcB5 à partir de la souche la plus puissante ont été synchronisées pendant toute la période de fermentation (96 h). Ils ont atteint les niveaux maximaux à 48 h d'incubation où la croissance bactérienne a atteint une densité optique de 1,32 à une longueur d'onde de 600 nm et la productivité enzymatique a atteint 125,2 U/mL (Fig. 1).

Relation entre la production de protéases (-■-) et la phase de croissance (-○-) dans une culture de S. typhimurium cultivée dans un milieu de base composé de (w/v) 1% fructose, 0,5% peptone, 0,5% NaCl, 0,15 % MgSO4·7H2O, 0,08 % KH2PO4, 0,02 % K2HPO4, 0,005 % CuSO4 et 0,001 % FeSO4. La fermentation a été effectuée sur un agitateur rotatif à la vitesse de 150 tr/min à 37 ° C et un pH initial de 7,0 pendant 48 h. Il existe une corrélation très positive entre la croissance bactérienne et la productivité enzymatique puisque le coefficient de corrélation r = 0,886***. La valeur P bilatérale est donnée à 0,00, ce qui donne une corrélation linéaire très hautement significative.

Comme indiqué dans le tableau 1, l'enzyme UcB5 a été efficacement purifiée jusqu'à l'homogénéité électrophorétique à partir de cultures liquides de S. typhimurium à travers diverses étapes, y compris la chromatographie hydrophobe, d'échange d'ions et de filtration sur gel par Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B et Sephadex G-75, respectivement. L'activité spécifique finale de l'enzyme a été multipliée par 13,2 × et la récupération de 17,1 %. L'homogénéité électrophorétique de l'enzyme testée a été reflétée par le pic majeur d'activité de la protéase impliquant les fractions 18 à 42 obtenues lors de la dernière étape chromatographique. Après concentration de ces fractions, une SDS-PAGE a été réalisée (Fig. 2a) où elle a montré une bande proéminente à 35 kDa (Fig. 2b). La version précédente du gel SDS-PAGE est présentée dans la Fig. S1 supplémentaire.

Profil d'élution de l'UcB5 par Sephadex G-75 (a) et SDS-PAGE (b). Initialement, les protéines de culture ont été précipitées avec du sulfate d'ammonium à des concentrations de 30 à 70 %, puis chargées dans une colonne Phenyl Sepharose 6FF (1,5 × 20 cm2) suivie d'une colonne DEAE-Sepharose CL-6B (1,5 × 20 cm2). et une colonne Sephadex G-75 FF (2,5 × 100 cm2). Enfin, une analyse SDS-PAGE a été effectuée en utilisant un gel d'empilement à 5 % (p/v) et un gel de séparation à 15 % (p/v). Le gel est recadré avec un logiciel de peinture et la version précédente du gel se trouve dans le fichier d'informations supplémentaires.

La meilleure température de réaction pour l'activité protéolytique de UcB5 contre le substrat azocaséine a été détectée à 35 ° C (Fig. 3). De plus, l'enzyme était thermiquement stable en dessous de 55 °C pendant 60 min. Il a conservé 84 % de son activité initiale à 50 °C. Le pH idéal pour l'activité protéolytique de UcB5 contre le substrat a été établi à pH 8,0 (Fig. 4a). De plus, la stabilité du pH de UcB5 a été trouvée entre 8, 0 et 11, 0 pendant 60 min (Fig. 4a). À un pH de 8,0 à 11,0, l'enzyme a conservé 92 % de son activité d'origine. Comme en témoigne la précipitation des protéines, le point isoélectrique de la structure protéique de cette enzyme a été trouvé à pH 5,6 ± 0,2. Le niveau de précipitation a atteint 1,8 mg de protéines/mL (Fig. 4b).

Impact de la température à la fois sur l'activité protéolytique (-●-) et sur la stabilité (-○-). L'impact de la température sur l'activité enzymatique a été testé à pH 7,0 avec un tampon Tris-HCl 0,2 M en utilisant le substrat azocaséine. La stabilité à la température de l'UcB5 a été étudiée par son incubation sans substrat dans du Tris-HCl 0,2 M (pH 7,0) pendant 60 min. A la fin de l'incubation, l'activité restante a été évaluée. Il existe une corrélation très positive entre l'activité enzymatique et sa stabilité thermique puisque le coefficient de corrélation r = 0,738**. La valeur P bilatérale est donnée à 0,015, ce qui donne une corrélation linéaire hautement significative. Alors qu'il existe une corrélation très négative entre la stabilité de l'enzyme et la température dégagée du coefficient de corrélation r = − 0,915***. La valeur P bilatérale est donnée à 0,000, ce qui donne une corrélation linéaire très hautement significative. L'équation de régression estimée peut être exprimée par la stabilité de l'enzyme = 139,9–1,47 température.

Impact du pH à la fois sur l'activité protéolytique (-●-) et sur la stabilité (-○-) (a). La température de réaction a été ajustée à 35°C en présence d'azocaséine. La stabilité du pH de l'enzyme pure a été inspectée par son incubation sans le substrat à 35 ° C pendant 60 min avec différents pH, puis l'activité enzymatique restante a été évaluée à une valeur de pH de 8,0. Le pH isoélectrique basé sur le schéma de précipitation des protéines est indiqué en (b). Il existe une faible corrélation positive entre l'activité enzymatique et sa stabilité au pH puisque le coefficient de corrélation r = 0,487. La valeur P bilatérale est donnée à 0,109. Il existe une faible corrélation négative entre le pH et la protéine précipitée puisque le coefficient de corrélation r = - 556***. La valeur P bilatérale est donnée à 0,000 et l'équation de régression estimée peut être exprimée sous la forme d'une teneur en protéines = 1,522–0,122 pH.

Nos résultats ont indiqué que l'enzyme a montré différents degrés d'activités amidolytiques contre les substrats chromogéniques testés (tableau 2). Le substrat de protéase standard pour les protéases de la chymotrypsine et de la subtilisine, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA était le substrat le plus dégradé par l'UcB5 montrant une activité amidolytique de 28,9 µmol min-1 L-1. En outre, l'UcB5 a dégradé le substrat chromogénique D-Val-Leu-Lys-pNA et D-Phe-Pip-Arg-pNA. Cependant, il a montré l'action la plus faible contre D-Val-Leu-Arg-pNA. Les paramètres cinétiques pour l'UcB5 contre le substrat N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA étaient ; Km de 0,16 mM et Kcat/Km de 301 mM-1 S-1.

L'étude de l'effet des réactifs protéases et des cations sur l'activité enzymatique (tableau 3) offre une première compréhension de la nature de l'enzyme testée, de la nature du site actif et des apports de cofacteurs. Lors de l'étude de l'impact des cations sur l'activité amidolytique, il a été constaté qu'aucun d'entre eux n'était un activateur de l'enzyme. L'activité amidolytique en l'absence de métaux a été considérée comme étant de 100 %, par conséquent, l'activité relative était de 92 % pour Ba2+, 87 % pour Co2+, 62 % pour Zn2+, 102 % pour Fe3+, 84 % pour Ca2+, 98 % pour Mg2+, 65 % pour Cu2+, 49 % pour Mn2+, 67 % pour Cd2+, 103 % pour Ag2+ et 47 % pour les ions Hg2+.

Concernant l'impact des réactifs protéases, il a été constaté que l'activité protéase de UcB5 était inhibée par TLCK (1,2% d'activité relative), PMSF (17,3% d'activité relative), SBTI (31,3% d'activité relative), aprotinine (3,0% d'activité relative) , la pepstatine A (15,7 % d'activité relative) et la leupeptine (78,5 % d'activité relative) mais n'a pas été influencée par la 2,2′-bipyridine (102,2 % d'activité relative), le DTT (100,5 % d'activité relative), l'o-phénanthroline (99,5 % activité relative), le β-mercaptoéthanol (activité relative de 98,9 %) et les deux inhibiteurs de métalloprotéases EDTA (activité relative de 100,1 %) et EGTA (activité relative de 100,2 %) (tableau 2). De plus, nos résultats ont indiqué que les agents formant des mercaptides PHMB (99,7 % d'activité relative) et EAM (102,1 % d'activité relative) n'ont pas influencé l'activité protéolytique.

Ceci a été déterminé par rapport à plusieurs protéines naturelles à une concentration de 0,5 % (p/v). Considérant que l'activité de l'UcB5 contre la caséine était de 100 %, les activités relatives contre la fibrine, la gélatine, la mucine, l'hémoglobine, le fibrinogène, l'élastine, le collagène, les IgG et l'albumine sérique étaient de 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5, 0,0 et 12,7 %, respectivement. L'action protéolytique contre les protéines plasmatiques a également été confirmée lors de l'expérience suivante lors du test de son activité anticoagulante (tableau supplémentaire S1). En présence d'UcB5, le temps de coagulation du sérum sanguin a été prolongé à 81 s, soit 3,5 fois le temps de coagulation sans enzyme.

Au cours de l'expérience in vitro présentée dans le tableau supplémentaire S1, UcB5 à une dose de 15 µg d'enzyme/ml a montré une mort cellulaire de 63,8 % de la lignée cellulaire HT29 cultivée. En outre, il a provoqué une augmentation de 3,9 fois de l'hémolyse des globules rouges. De plus, une étude comparative in vivo avec une préparation de protéase active et une préparation de protéase inactivée par la chaleur a été réalisée dans le but de déterminer s'il existe une relation entre sa toxicité et l'activité enzymatique. Les préparations actives ont été utilisées à raison de 60 µg à 4 µg de poids corporel de protéase/souris (tableau supplémentaire S2). À des concentrations de 60 µg et 30 µg, la mort est survenue pour tous les animaux testés dans les 2 h, alors que 4 et 1 souris sur six sont mortes dans les 48 h avec des traitements de 15 µg et 8 µg, respectivement. Aucune létalité n'a été notée avec un traitement de 4 ug de l'enzyme. D'autre part, aucune des souris n'a été tuée par la préparation enzymatique inactivée par la chaleur. La DL50 calculée à 48 h était de 15,75 µg de protéase/poids corporel de la souris (tableau supplémentaire S2).

L'étude TEM sur les souris atteintes a révélé que UcB5 a induit une vésiculation (V) à l'intérieur des hépatocytes et que la membrane nucléaire (nm) s'est malformée avec l'accumulation d'hétérochromatine (Hc). La membrane cellulaire et le réticulum endoplasmique rugueux (ER) des hépatocytes ont complètement disparu (Fig. 5).

Micrographies TEM montrant les changements ultrastructuraux dans les hépatocytes des souris traitées et témoins. (a) Un hépatocyte typique montre une membrane cellulaire intacte (cm) et une membrane nucléaire intacte (nm) contenant de l'euchromatine (Ec). En outre, il montre un réticulum endoplasmique rugueux intact (ER) et des mitochondries normales étendues (M). (b) Une cellule hépatique d'une souris ayant reçu une préparation active de protéase UcB5. Il montre une vésiculation (V) et une membrane nucléaire malformée (nm) avec de l'hétérochromatine (Hc). Il montre la disparition de la membrane cellulaire et du réticulum endoplasmique rugueux. L'activité d'endommagement des cellules in vivo a été évaluée en expérimentant avec les souris BALB/c hébergées en six groupes. En bref, une UcB5 purifiée dans un volume total de 1 ml a été inoculée à chaque souris par voie intrapéritonéale. Chaque souris a été inoculée avec une préparation enzymatique inactivée par la chaleur pour le groupe témoin universel. Les foies ont été prélevés sur les animaux sacrifiés et les animaux témoins et fixés. Enfin, des sections ultrafines de 70 nm d'épaisseur ont été prises avec un ultramicrotome RMC et supportées sur des grilles de cuivre pour un examen au microscope électronique sous JEOL 1010 TEM.

La capacité des micro-organismes pathogènes à provoquer des maladies dépend du développement de protéases extracellulaires, selon plusieurs recherches publiées. Bien que la méthode d'action précise ne soit pas claire, il semble que ces enzymes microbiennes interfèrent avec le système de protéase de l'hôte17. Dans nos études antérieures, nous avons rapporté la pathogenèse de la protéase KB76 de Brevibacterium otitidis18 et de la protéase ZuhP13 de Pseudomonas aeruginosa17. Dans cet article, nous avons séparé et caractérisé une possible enzyme cytotoxique nommée protéase UcB5 de la bactérie S. typhimurium.

La souche productrice de protéase la plus efficace, la souche UcB5, a été identifiée par les données de séquençage du gène 16S rDNA comme S. typhimurium. Après 48 h d'incubation, la production de protéase UcB5 (125 U/mL) et la croissance bactérienne étaient synchronisées au plus haut niveau (Fig. 1). Ainsi, on peut déduire que la protéase UcB5, comme la protéase ZuhP13 de P. aeruginosa, est une enzyme principale nécessaire au développement bactérien17. Contrairement à la protéase de l'agent pathogène des poissons, Yersinia ruckeri a démontré le meilleur rang de productivité à 12 h19. Fait intéressant, l'UcB5 a été produit dans un milieu de base dépourvu du sous-état de caséine (voir matériaux et méthodes) qui est une indication d'une enzyme constitutive et non inductible.

L'activité spécifique finale de l'enzyme isolée a été multipliée par 13,2, avec une récupération de 17,1 %. SDS-PAGE des protéines de la dernière colonne (Fig. 2a) a révélé une bande distincte à 35 kDa (Fig. 2b). Cette masse moléculaire coïncide avec les protéases pathologiques de P. aeruginosa20 alors que contrairement aux protéases de Legionella pneumophila (38 kDa21), Vibrio pelagius (39 kDa22) Vibrio parahaemolyticus (43 kDa23), Br. otitidis (47 kDa18) et Y. ruckeri (47 kDa19).

Avec une ressemblance avec la protéase virulente de Y. ruckeri19, 35 ° C s'est avéré être la température de réaction optimale pour l'activité protéolytique de UcB5 (Fig. 3). Alors que 40 °C était la meilleure pour la protéase ZuhP1317, et 50 °C était la meilleure pour la protéase ME424. De plus, UcB5 s'est avéré thermostable en dessous de 55 ° C pendant 60 min (Fig. 3). En se référant à la littérature, il est plus thermostable en évaluation avec la protéase virulente de Y. ruckeri (inhibition complète à 55 °C19) et plus thermolabile en comparaison avec la protéase san-ai de P. aeruginosa (stable à 60 °C pendant 90 min25.

L'activité protéolytique d'UcB5 s'est avérée meilleure à pH 8,0 (Fig. 4a), ce qui est similaire aux protéases pathologiques de Y. ruckeri19, de la souche Bacillus cereus BG126 et de la souche KCTC 367427. La baisse majeure de l'activité protéolytique à un pH inférieur les valeurs peuvent être dues au fait que les valeurs de pH inférieures coïncident avec le point isoélectrique (pI, 5,6 ± 0,2, Fig. 4b). La protéase KB76 de Br. otitidis18 et la protéase endommageant la cornée d'une souche de P. aeruginosa4 ont également été signalées comme ayant des pI similaires par d'autres chercheurs. De plus, la stabilité du pH de la protéase UcB5 a été trouvée entre 8 et 11 pendant 60 min (Fig. 4a) similaire à la protéase d'Aeromonas veronii PG0128 par opposition à la protéase ZuhP1317 et à la protéase ME4 de P. aeruginosa24 qui étaient stables à pH 6 –9 pendant 60 min.

Contre les substrats chromogéniques étudiés, l'enzyme a affiché divers degrés d'activité amidolytique (tableau 2). Le substrat de protéase standard pour les protéases de la chymotrypsine et de la subtilisine, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA était le substrat le plus dégradé par l'UcB5 montrant une activité amidolytique de 28,9 µmol min-1 L-1. De plus, l'UcB5 a dégradé le substrat chromogénique D-Val-Leu-Lys-pNA qui est le substrat standard des protéases de la plasmine, et D-Phe-Pip-Arg-pNA qui est le substrat des protéases de la thrombine. Cependant, l'enzyme a démontré la moindre activité contre D-Val-Leu-Arg-pNA, le substrat chromogénique des types de protéases de kallikréine. À partir de ces découvertes, nous pouvons conclure que UcB5 est similaire à la subtilisine ou à la chymotrypsine car elle hydrolyse les liaisons Lys-peptide plus facilement que les liaisons Arg-peptide. Fait intéressant, la subtilisine UcB5 a attaqué D-Phe-Pip-Arg-pNA plus efficacement que D-Val-Leu-Arg-pNA comme la subtilisine FS33 protéase29 qui la distingue des autres subtilisines.

Les valeurs cinétiques pour UcB5 contre le substrat N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA étaient ; Km de 0,16 mM et Kcat/Km de 301 mM-1 S-1. Concernant les autres subtilisines, ZuhP13 de P. aeruginosa a montré une efficacité catalytique de 4,62 × 107 M−1 S−1 avec Kcat de 1,27 S−117. L'efficacité catalytique de ZapA de Proteus mirabilis N17-12 contre Phe-Ser était de 291 mM-1 S-1, Km était de 13,6 µM et Kcat était de 3,96 S-1 alors que l'efficacité catalytique contre Phe-Leu était de 13 mM-1 S-1, Km était de 2,3 µM et Kcat était de 0,03 S-130.

Lors de l'examen de l'effet des cations sur l'activité amidolytique, aucun des cations n'était un activateur enzymatique. Lors de l'examen des effets des réactifs de protéase, il a été constaté que la 2,2'-bipyridine, le DTT, l'o-phénanthroline, le β-mercaptoéthanol et les deux inhibiteurs de métalloprotéase (EDTA et EGTA) n'affectaient pas l'activité de UcB5 (tableau 2 ). De plus, les agents formant des mercaptides (PHMB et EAM) n'ont pas affecté l'activité protéolytique. En conséquence, nous proposons que les groupes tryptophane (indole) et sérine (hydroxy) soient situés au niveau ou à proximité du centre actif de UcB5. En combinant nos découvertes, nous proposons que UcB5 appartient à des protéases à sérine similaires à la protéase virulente espP d'E. coli31. En nous référant à la littérature, nous avons remarqué que les sérine protéases virulentes sont rares en comparaison avec les métalloprotéases virulentes. Ce dernier type a été découvert dans les extraits de Y. ruckeri19, P. mirabilis N17-1230 et presque toutes les souches de P. aeruginosa24,25.

L'activité relative d'UcB5 contre la fibrine, la gélatine, la mucine, l'hémoglobine, le fibrinogène, l'élastine, le collagène, les IgG et l'albumine sérique était de 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5, 0,0 et 12,7 %, respectivement. La non-protéolyse de l'immunoglobuline de type G peut être prometteuse dans la production de protéines chimériques à base d'UcB5 et d'IgG pour cibler des cellules indésirables spécifiques. L'expérience ultérieure, qui a évalué les propriétés anticoagulantes de l'enzyme, a encore validé l'action protéolytique contre les protéines plasmatiques (tableau supplémentaire S1). En présence d'UcB5, le temps de coagulation du sang a été prolongé à 81 s, soit 3,5 fois le temps de coagulation sans enzyme. La capacité d'UcB5 à détruire la fibrine et le fibrinogène soutient l'idée que les protéases microbiennes facilitent la translocation bactérienne à l'intérieur du corps. En conséquence, nous sommes favorables à l'utilisation d'un inhibiteur de protéase approprié en conjonction avec des antibiotiques plutôt que de simples antibiotiques seuls pour traiter les infections bactériennes à l'intérieur du corps humain32.

Au cours de l'expérience in vitro décrite dans le tableau supplémentaire S1, UcB5 a montré une mort cellulaire de 63,8 % de la lignée cellulaire HT29 cultivée. En outre, il a provoqué une augmentation de 3,9 fois de l'hémolyse des globules rouges. En conséquence, la désintégration de la cellule et de la membrane RBC semble être une phase dans le mode d'action de UcB5. Lorsque cela s'est produit, l'enzyme a commencé à réagir avec l'hémoglobine et d'autres protéines internes importantes. Cette caractéristique de l'UcB5 pourrait être à l'origine d'hémorragies observées dans les cavités internes du thorax et de l'abdomen des animaux disséqués. Les activités hémolytiques et hémorragiques présentées de l'UcB5 coïncident avec la protéase A de V. parahemolyticus no. 9323 et la protéase ZuhP13 de P. aeruginosa17.

Lors de l'injection d'UcB5 chez la souris, une vésiculation (V) s'est produite à l'intérieur des hépatocytes et les membranes nucléaires (nm) se sont déformées en raison de l'accumulation d'hétérochromatine (Hc). De plus, la TEM a révélé que la membrane cellulaire et le réticulum endoplasmique rugueux (ER) des hépatocytes avaient totalement disparu (Fig. 5). La lyse cellulaire et nucléaire provoquée par UcB5 peut être due à une nécrose et non à l'apoptose puisqu'il n'y a pas d'altération des configurations mitochondriales (M). Concernant les protéases pathologiques citées, Pseudoalteromonas sp. Les protéases N10 et V. vulnificus ont généré une altération des protéines musculaires et ont présenté une nécrose profonde de la plaie, respectivement33. Les poissons ont subi des dommages cellulaires importants dus à la protéase de Y. ruckeri19. D'autre part, les chercheurs ont démontré que les protéases des streptocoques induisaient à la fois une fasciite nécrosante et l'apoptose cellulaire des tissus hôtes34.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

Diéthylaminoéthyl

Diméthylsulfoxyde

1,4-Dithiothréitol

Acétimidate d'éthyle d'aminobenzamidine

Acide Éthylène Diamine Tétra-Acétique

Acide éthylèneglycotétracétique

Immunoglobuline classe G

Bouillon Luria-Farming

Réactif bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

Biguanide de polyhexaméthylène

Point isoelectrique

Fluorure de phénylméthylsulfonyle

P-nitroaniline

Inhibiteur de trypsine de soja

Électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et de polyacrylamide

Gélose Salmonella Shigella

Microscope électronique à transmission

Tosyl-l-lysine chlorométhyl cétone

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Les auteurs remercient le sous-comité de la recherche et de l'innovation du ministère de l'Éducation d'Arabie saoudite pour le financement de ce travail de recherche par le biais du projet numéro IF-2020-028-BASRC de l'Université Imam Abdulrahman bin Faisal (IAU) / Centre de recherche scientifique fondamentale et appliquée. (BASRC).

Département de biologie, Collège des sciences, Université Imam Abdulrahman Bin Faisal (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabie saoudite

Essam Kotb, Haifa A. Alqahtani, Hussah A. Al-shwyeh, Sakina M. Algarudi & Hanan Almahasheer

Centre de recherche scientifique fondamentale et appliquée, Université Imam Abdulrahman Bin Faisal, PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabie saoudite

Essam Kotb, Hussah A. Al-shwyeh et Sakina M. Algarudi

Département de botanique et de microbiologie, Faculté des sciences, Université Kafrelsheikh, Kafrelsheikh, 33516, Égypte

Baher A. El-Nogoumy

Département de statistique, Faculté de commerce, Université Al-Azhar (Branche des filles), PO Box 11751, Le Caire, Égypte

Asmaa A. Ahmed

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EK a réalisé la conception de l'étude et des études enzymologiques. BAE a réalisé la caractérisation bactérienne et l'étude in vivo. L'AHA a contribué à l'étude in vivo. AAA a effectué l'analyse statistique et le travail logiciel, y compris la détermination des données. HAAl. aidé dans les études enzymologiques. SMA a aidé à la collecte d'échantillons et au travail sur le logiciel. HA a aidé à l'échantillonnage environnemental et à l'édition du manuscrit. Tous les auteurs ont aidé à rédiger le manuscrit et approuvé la forme finale.

Correspondance à Essam Kotb.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kotb, E., El-Nogoumy, BA, Alqahtani, HA et al. Une sérine protéase cytotoxique putative de Salmonella typhimurium UcB5 récupérée à partir d'un hamburger insuffisamment cuit. Sci Rep 13, 3926 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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Reçu : 19 septembre 2022

Accepté : 10 février 2023

Publié: 09 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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