Reconstitution de la biosynthèse des alcaloïdes indoles monoterpènes dans le génome modifié Nicotiana benthamiana

Communications Biology volume 5, Article number: 949 (2022) Citer cet article

3895 accès

10 Citations

26 Altmétrique

Détails des métriques

Les alcaloïdes indoliques monoterpéniques (MIA) sont une classe diversifiée de produits naturels végétaux qui comprennent un certain nombre de composés importants sur le plan médical. Nous avons entrepris de reconstituer la voie de la strictosidine, un intermédiaire clé de tous les MIA, à partir du métabolisme central chez Nicotiana benthamiana. Un inconvénient de cet hôte est que son riche métabolisme de fond entraîne la dérivation de certaines molécules produites de manière hétérologue. Ici, nous utilisons l'analyse transcriptomique pour identifier les glycosyltransférases qui sont régulées positivement en réponse à des intermédiaires biosynthétiques et produire des lignées végétales avec des mutations ciblées dans les gènes qui les codent. L'expression de la voie MIA précoce dans ces lignées produit un profil de produit plus favorable. La biosynthèse de la strictosidine a été reconstituée avec succès, avec les meilleurs rendements obtenus par la co-expression de 14 enzymes, dont une enzyme majeure de type protéine de latex (MLPL) de Nepeta (cataire) est essentielle pour améliorer le flux à travers la voie iridoïde. L'élimination des glycosyltransférases endogènes n'a pas d'impact sur les rendements de la strictosidine, soulignant que le flux métabolique des enzymes de la voie vers un intermédiaire biosynthétique stable minimise la nécessité de modifier le métabolisme endogène de l'hôte. La production de strictosidine in planta élargit la gamme de produits MIA aptes à la synthèse biologique.

L'application d'approches de biologie synthétique à l'ingénierie des systèmes végétaux a facilité les progrès dans le contrôle et l'expression des voies biosynthétiques, permettant aux plantes de servir de châssis de production biochimique alternatif1,2. Un parent du tabac, N. benthamiana3,4 est devenu une espèce privilégiée pour la production végétale de protéines pharmaceutiques5 et la reconstitution des voies métaboliques2. Les succès incluent la production à l'échelle du gramme de triterpénoïdes6 et la production à l'échelle du milligramme d'étoposides7. Cependant, plusieurs études ont rapporté l'accumulation de produits secondaires involontaires, vraisemblablement produits par les activités hors cible des enzymes endogènes de N. benthamiana telles que les oxydases et les glycosyltransférases8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. Bien que l'activité des enzymes endogènes ait été exploitée dans certaines études pour produire de nouvelles molécules9 ou pour compenser l'absence d'une enzyme connue19, la dérivatisation des molécules est pour la plupart un inconvénient, réduisant la pureté et le rendement potentiels du composé cible.

Les alcaloïdes indoliques monoterpéniques (MIA) sont un grand groupe de produits naturels d'origine végétale dont plus de 3000 ont été identifiés20. Cette classe de molécules comprend de nombreux composés de valeur médicale utilisés pour traiter la dépendance, les maladies cardiaques, la démence, la douleur, le cancer, le paludisme et le diabète. La plante productrice de MIA la mieux caractérisée est Catharanthus roseus (pervenche de Madagascar), qui fabrique plus de 130 MIA, dont la vinblastine et la vincristine bioactives, qui sont utilisées comme chimiothérapies. Cependant, ces molécules précieuses sont présentes à de faibles concentrations chez C. roseus (0,0005 % poids sec)21, ce qui limite leur disponibilité. La culture de masse de cellules de C. roseus est faisable, mais une lignée cellulaire qui produit régulièrement ces molécules anticancéreuses n'a pas encore été signalée22. Bien que des méthodes d'expression transitoire23 et de transformation génétique stable24 de plantes C. roseus aient été rapportées, la modification génétique de la plante hôte native pour augmenter les rendements de ces composés reste techniquement difficile. De plus, la complexité structurelle de nombreux MIA signifie que la synthèse chimique est souvent difficile25,26. Par conséquent, des voies de production alternatives sont souhaitables et la découverte récente d'étapes manquantes dans la voie de la vinblastine27,28 fait de la reconstruction de la voie chez un hôte hétérologue une option de plus en plus attrayante.

La réalisation de la production de quantités thérapeutiquement utiles de MIA nécessite une ingénierie de voie pour maximiser le flux métabolique à travers les premières parties de la voie. La strictosidine est le dernier intermédiaire biosynthétique commun dont dérivent les plus de 3000 MIA connus. La reconstitution de sa voie de biosynthèse en ~11 étapes dans les micro-organismes peut nécessiter un réglage approfondi des conditions d'expression enzymatique et une optimisation de la souche29, par exemple, une mauvaise expression de la géraniol 8-hydroxylase (G8H) a entravé la production de strictosidine dans la levure30. L'obtention de rendements utiles de molécules telles que la vinblastine, qui nécessiterait l'expression de plus de 16 enzymes au-delà de la strictosidine, nécessitera probablement une ingénierie substantielle, bien que la levure ait récemment été conçue pour produire de l'ajmalicine via l'intégration génomique de 29 cassettes d'expression, démontrant la potentiel de reconstruction hétérologue des voies de biosynthèse des produits naturels végétaux effort31.

Alors que la levure reste un hôte prometteur pour l'expression hétérologue des voies métaboliques, les protéines d'origine végétale nécessitent souvent moins d'optimisation et d'ingénierie pour une expression réussie dans une plante hôte. L'expression dans N. benthamiana a été utilisée par Miettinen et ses collaborateurs pour reconstituer la voie iridoïde de C. roseus, permettant d'élucider les quatre étapes manquantes restantes de la voie26. Cependant, ils ont rencontré un goulot d'étranglement métabolique à mi-chemin de la voie en 13 étapes nécessitant une reconstitution en deux phases, la dernière partie nécessitant la fourniture d'un substrat intermédiaire (iridotrial) afin d'obtenir la strictosidine27. De plus, le riche métabolisme endogène de N. benthamiana a agi sur les intermédiaires hydrophobes précoces de la biosynthèse de la strictosidine pour produire une variété de produits dérivés sans issue.

Ici, nous avons conçu avec succès la production de novo de strictosidine chez N. benthamiana. Nous identifions les glycosyltransférases endogènes qui dérivatisent les intermédiaires de la voie précoce et démontrons que moins de dérivés s'accumulent dans les lignées végétales avec des mutations de perte de fonction dans les gènes codant pour ces enzymes. Nous utilisons des gènes supplémentaires qui améliorent la production de népétalactol et permettent de produire des niveaux élevés de strictosidine à partir du métabolisme central de N. benthamiana sans avoir besoin de supplémentation en précurseurs ou intermédiaires de métabolites. Globalement, cette étude démontre le potentiel de N. benthamiana comme châssis de bioproduction de petites molécules.

La strictosidine est dérivée du terpénoïde sécologanine. La sécologanine appartient à la classe iridoïde des monoterpènes, qui sont dérivés de l'oxydation, de la cyclisation réductrice et de la dérivatisation substantielle du géraniol. Après formation, la sécologanine subit une condensation et une cyclisation avec la tryptamine pour former la strictosidine. Des études antérieures visant à l'expression hétérologue des voies de biosynthèse des terpénoïdes de faible poids moléculaire chez N. benthamiana ont rapporté l'accumulation d'intermédiaires biosynthétiques dérivés29. Pour étudier la dérivatisation dans les premières étapes de la voie iridoïde, nous avons exprimé de manière transitoire les premières enzymes de la voie de la strictosidine en co-infiltrant N. benthamiana avec des souches d' A. tumefaciens contenant des plasmides codant pour les étapes de la voie jusqu'au cis-trans népétalactol (Fig. 1). Pour améliorer le pool de substrat de géraniol pyrophosphate (GPP) de la voie plastidiale 2-C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate/1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate (MEP/DOXP), nous avons inclus un géranyl bifonctionnel/ la géranylgéranyl pyrophosphate synthase de Picea abies (PaGPPS) et la 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) de C. roseus (CrDXS), toutes deux ciblées sur le plaste. Pour produire du géraniol, ceux-ci ont été co-exprimés avec la géraniol synthase de C. roseus (CrGES), précédemment démontrée pour permettre la production hétérologue de géraniol chez les plantes32. Nous avons ensuite ajouté les trois premières étapes de la voie de la strictosidine dédiée : la géraniol 8-oxydase (CrG8H), la 8-hydroxygéraniol oxydoréductase (CrGOR) et l'iridoïde synthase (CrISY) pour produire du cis-trans népétalactol et effectuer une spectrométrie de masse à haute résolution de N infectés de manière transitoire. benthamiana laisse identifier les produits enzymatiques. Comme indiqué par Dong et ses collaborateurs32, nous avons constaté que l'expression transitoire de CrDXS, PaGPPS et CrGES produit une gamme de dérivés glycosylés et oxydés non volatils de géraniol (Fig. 1 et Tableau supplémentaire 1). L'ajout d'étapes ultérieures de la voie, jusqu'au népétalactol cis-trans, a encore modifié le profil des produits dérivés. En général, moins de dérivés se sont accumulés à mesure que davantage d'étapes de voie ont été ajoutées, ce qui suggère que la forte expression constitutive a permis aux enzymes de la voie de surpasser les substrats endogènes (Fig. 1).

Une modification courante était l'ajout de sucres pentose et hexose, par exemple, pic 1, hexosyl hydroxygeraniol [M + HCOOH-H], 3,84 min, m/z 377,1817 ; Pic 2, hexosyl hydroxycitronellal [M + HCOOH-H], 4,12 min, m/z 379,1974; Pic 3, acide trihexosylgéranique [M + HCOOH-H], 4,35 min, m/z 699,2703); Pic 4, pentosyl hexosyl géraniol [M + HCOOH-H], 5,32 min, m/z 493,2288; Pic 5, acétyl dihexosyl géraniol [MH], 5,454 min, m/z 519,2445 ; DXS, 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; GPPS, géranyl diphosphate synthase; GES, géraniol synthase ; G8H, géraniol 8-oxydase ; GOR, 8-hydroxygéraniol oxydoréductase; ISY, iridoïde synthase.

L'une des caractéristiques communes de la dérivatisation était l'ajout de sucres pentose et hexose. Les enzymes principalement responsables de la glycosylation des produits naturels végétaux, y compris les monoterpènes, appartiennent à la famille 133 des glycosyltransférases. Nous avons émis l'hypothèse que nombre de ces UGT sont susceptibles d'être impliquées dans la biosynthèse de métabolites secondaires endogènes utilisés, par exemple, dans la défense. Alternativement, ces UGT peuvent être impliqués dans la détoxification d'une variété de métabolites. Nous avons donc considéré que l'introduction de mutations de perte de fonction dans les gènes les codant n'aurait probablement pas d'impacts substantiels sur le développement des plantes cultivées dans les environnements contrôlés utilisés pour l'agroinfiltration. Cependant, alors qu'un grand nombre d'UGT peuvent être facilement identifiés en recherchant dans les génomes de toutes les plantes vasculaires des homologues appropriés, prédire les spécificités du substrat et identifier les gènes individuels responsables de la modification de métabolites spécifiques est difficile34.

Pour déterminer si les changements dans l'expression des gènes étaient corrélés aux modifications chimiques observées, nous avons effectué une analyse du transcriptome d'échantillons de feuilles infiltrés par la voie iridoïde. Comme une réponse transcriptionnelle substantielle à l'agroinfiltration a déjà été observée35, nous avons comparé les changements d'expression aux témoins non infiltrés et aux plantes témoins infiltrées avec une protéine fluorescente verte (GFP) exprimée de manière constitutive (voir méthodes). Nous avons observé que l'expression de certains UGT augmentait en réponse à l'infiltration, tandis que d'autres augmentaient spécifiquement en réponse à l'expression de la voie du géraniol ou du népétalactol (tableau supplémentaire 2). Nous avons également effectué une analyse phylogénétique de toutes les UGT de la famille 1 identifiées dans le transcriptome foliaire de N. benthamiana (voir méthodes), en étudiant leur relation avec celles trouvées chez Arabidopsis thaliana et avec les UGT végétales précédemment caractérisées connues pour être actives sur les substrats de géraniol et de népétalactol (Fig. 2 et Fig. 1 supplémentaire).

Les groupes AP sont annotés selon la nomenclature utilisée par Caputi et al. 201233. Les taxons marqués indiquent des enzymes dans lesquelles des mutations ciblées médiées par Cas9 ont été introduites par la suite. Les cercles gris pleins aux nœuds indiquent des supports d'amorçage> 95. La barre d'échelle représente le nombre de substitutions par site. Un arbre avec tous les taxons et les valeurs bootstrap est fourni dans la Fig. 1 supplémentaire.

Nous avons émis l'hypothèse qu'une façon d'améliorer le châssis de N. benthamiana serait de supprimer ces UGT endogènes en introduisant des mutations dans les gènes qui les codent. En utilisant à la fois les profils d'expression et la sélectivité de substrat prédite, nous avons sélectionné des cibles génétiques pour la mutagenèse ciblée médiée par Cas9. Nous avons ensuite construit 8 plasmides ciblant un total de 25 UGT (tableau 1). Nous avons d'abord conçu trois vecteurs binaires pour la transformation stable de plantes N. benthamiana de type sauvage (pEPQDPKN0720, pEPQDPKN0724, pEPQDPKN0361) (Figs. 2 à 4 supplémentaires). Ces constructions encodaient des sgARN ciblant des gènes codant pour les UGT des groupes D, E et G, précédemment montrés actifs sur le géraniol36,37 ainsi que des UGT non caractérisés des mêmes groupes avec la logique qu'ils peuvent être actifs sur le même substrat (tableau 1 et Tableau supplémentaire 3). Comme les UGT ciblés par chaque construction étaient étroitement liés, certains sgARN étaient capables de cibler plus d'un gène. Par conséquent, chaque construction codait pour six sgARN ciblant le premier ou le deuxième exon de quatre UGT du groupe D, cinq UGT du groupe E ou trois UGT du groupe G (tableau 1 et figures supplémentaires 2 à 4). Ces constructions ont été délivrées à des plantes de type sauvage et les génotypes de plantes transgéniques régénérées (T0) ont été déterminés. Nous avons écarté les lignées dont le génotype n'était pas clair ou indiquait un chimérisme génétique potentiel et avons sélectionné des lignées présentant des mutations homozygotes, hétérozygotes ou bialléliques aux emplacements cibles. Les génotypes ont été confirmés dans les plantes T1, ainsi que la présence ou l'absence de l'ADN-T. Les 18 sgARN ont introduit des mutations dans au moins une plante T0. Notamment, nous n'avons pu récupérer aucune plante présentant des mutations de décalage de cadre dans NbUGT72B58 et NbUGT72B35, cependant, nous avons pu récupérer des lignées présentant des mutations dans chacun de ces gènes en combinaison avec d'autres UGT du groupe E (tableau 1). Nous avons sélectionné six plantes T1 avec des mutations dans différentes combinaisons de 12 gènes individuels (tableau 1). Toutes les lignées étaient morphologiquement normales sans changements évidents de croissance et de développement et mûrissaient en même temps que les lignées témoins.

Nous avons également conçu et construit cinq vecteurs viraux basés sur le TMV codant pour des sgARN mobiles en utilisant les méthodes précédemment décrites par Ellison et ses collègues38. Quatre vecteurs contenaient des sgARN mobiles ciblant les UGT qui étaient soit fortement régulés à la hausse après l'infiltration (pEPQDKN0777), fortement régulés à la hausse en réponse à l'expression de la voie du géraniol (pEPQDKN0778) ou de la voie du népétalactol (pEPQDKN0779) ou avaient des comptes normalisés élevés après l'expression de la voie du népétalactol ( pEPQDKN0780) (tableau 1, Fig. 5 supplémentaire et tableau supplémentaire 2). Un vecteur final a codé trois sgARN mobiles ciblant quatre UGT connus pour être actifs sur le géraniol37 (pEPQDKN0781) (Tableau 1, Fig. 5 supplémentaire et Tableau supplémentaire 3). Ces vecteurs ont été infiltrés dans des plantes transgéniques exprimant constitutivement Cas9. Les graines de descendance (désignées par E1) ont été collectées à partir de gousses formées sur des tiges dans lesquelles des mutations ont été détectées aux sites cibles (voir méthodes). Les génotypes des plantes E1 ont été analysés, en sélectionnant à nouveau des lignées présentant des mutations homozygotes, hétérozygotes ou bialléliques aux emplacements cibles. Dans l'ensemble, la méthode sgRNA mobile était moins efficace, huit sgRNA mobiles sur quinze introduisant des mutations au niveau de leur cible. Cela a abouti à la sélection de cinq lignées E1, chacune avec des mutations dans un, deux ou trois UGT cibles (tableau 1 et Fig. 5 supplémentaire). Comme ci-dessus, il n'y a eu aucun changement dans la croissance ou le développement.

Pour déterminer si l'introduction de mutations dans les UGT réduirait la présence de dérivés du géraniol, des plantes mutées dont les génotypes de tous les loci cibles avaient été confirmés ont été infiltrées avec des souches d'agrobactérie codant pour les enzymes de la voie pour produire soit du géraniol, soit du cis-trans nepetalactol. Les échantillons ont été analysés pour les dérivés par UHPLC/MS comme discuté précédemment et le profil métabolique a été comparé aux lignées parentales (type sauvage et lignées transgéniques Cas9) et à la descendance d'une lignée témoin non transgénique et non mutée régénérée en culture tissulaire et cultivée dans des conditions identiques.

Les plantes présentant des mutations dans l'UGT du groupe A, NbUGT94E7, n'ont pas accumulé d'acide trihexosyl géranique (m/z 699,2713, [M + HCOOH-H]) après l'expression des enzymes de la voie pour produire du géraniol ou du népétalactol (Fig. 3, Données supplémentaires 1 , figures supplémentaires 6 et 7). La présence d'acétyl dihexosyl géraniol (m/z 519,2445, [MH]) a également été éliminée dans les échantillons dans lesquels les enzymes de la voie de production du népétalactol étaient exprimées. De plus, trois lignées avec des mutations dans le groupe G NbUGT85 A73 en combinaison avec NbUGT72AY1 (groupe E) ou NbUGT85A74 et NbUGT85A104 (groupe G) ont accumulé moins ou pas d'hexosyl hydroxygeraniol (m/z 377,1817, [M + HCOOH-H]) , hexosyl hydroxycitronellal (m/z 379,1974, [M + HCOOH-H]), pentosyl hexosyl géraniol (m/z 493,2288, [M + HCOOH-H]) ou acétyl dihexosyl géraniol (m/z 519,2445, [MH]) ( Fig. 3, données supplémentaires 1, figures supplémentaires 6 et 7). Fait intéressant, ces pics n'étaient absents que dans les échantillons dans lesquels les enzymes de la voie de production du népétalactol étaient exprimées.

Les identités attribuées des pics 1 à 5 sont fournies sur la figure 1. Les astérisques indiquent que l'activité sur le géraniol a déjà été rapportée. Les valeurs et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard de n = 3 répétitions biologiques. Pour la comparaison par paires de toutes les lignées mutées aux trois lignées de contrôle (barres grises), les moyennes suivies d'une lettre grecque commune (α, β, γ, δ) ne sont pas significativement différentes par une ANOVA unidirectionnelle avec post-hoc Tukey HSD au seuil de signification de 5 %. Les parcelles sans valeurs de lettres grecques n'ont pas de lignes expérimentales avec des différences significatives par rapport aux trois lignes de contrôle.

Nous nous sommes ensuite concentrés sur l'extension de la voie iridoïde dans le but de reconstituer la voie jusqu'à l'intermédiaire strictosidine central. Une tentative précédemment rapportée a rencontré un goulot d'étranglement métabolique nécessitant l'infiltration d'iridotrial afin d'obtenir de la strictosidine38. La voie de biosynthèse pour la production de cis-trans népétalactone dans le genre Nepeta partage la voie sécoiridoïde de C. roseus jusqu'à la réduction stéréosélective du 8-oxogéranial en un intermédiaire énol par la synthase iridoïde dépendante du NADPH (ISY)39. Il a récemment été démontré que chez Nepeta, ISY fonctionne en combinaison avec des déshydrogénases-réductases à chaîne courte (NEPS) liées au népétalactol ou une enzyme majeure de type protéine de latex (MLPL) pour contrôler la stéréosélectivité de la fermeture de l'anneau40,41. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'ajout du MLPL de Nepeta mussinii (alias Nepeta racemosa), qui est spécifique de la stéréochimie trouvée dans la strictosidine, améliorerait le flux à travers la voie chez N. benthamiana. Des efforts récents de reconstitution dans des systèmes avec levure31 et sans cellule42 ont également indiqué que cette enzyme améliore considérablement le rendement.

L'infiltration de toutes les enzymes de la voie pour produire du 7-DLA sans MLPL n'a pas produit de pic pour le 7-DLA (m/z attendu 359,1349) ou le 7-DLA acylé (m/z attendu 401,1447), conformément aux rapports précédents39 (Fig. 4) . Cependant, l'inclusion de MLPL a produit un pic clair de m/z 359,1342 qui correspond au temps de rétention de la norme 7-DLA. L'exclusion de l'acide 7-désoxyloganétique glucosyl transférase (7-DLGT) produit un pic avec le même m/z mais cela ne correspond pas au temps de rétention du 7-DLA. Il est possible que les UGT endogènes soient capables d'utiliser l'acide 7-désoxyloganétique pour produire un ester de glucose. Comme observé avec la voie précoce, une forte expression constitutive des gènes de la voie (dans ce cas, 7-DLGT) peut supplanter les enzymes natives, entraînant l'absence de ce pic d'ester de glucose putatif dans les spectres de la voie 7-DLA complète.

L'expression transitoire de toutes les enzymes de la voie plus MLPL produit un pic de 359,1342 m/z qui correspond à la masse et au temps de rétention d'un standard d'acide 7-désoxyloganique (7-DLA). La voie reconstituée sans DLGT produit également un pic de 359,1343 m/z mais à un temps de rétention différent, probablement dû aux glycosyltransférases endogènes de N. benthamiana produisant l'ester de glucose de l'acide 7-désoxyloganétique. DXS, 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; GPPS, géranyl diphosphate synthase; GES, géraniol synthase ; G8H, géraniol 8-oxydase; GOR, 8-hydroxygéraniol oxydoréductase; ISY, iridoïde synthase; MLPL, major protéine-like de latex ; IO, iridoïde oxydase; 7-DLGT, glucosyltransférase de l'acide 7-désoxyloganétique.

En nous appuyant sur les conditions expérimentales qui ont produit avec succès le 7-DLA, nous avons ajouté séquentiellement les cinq enzymes de la voie restantes et mesuré les intermédiaires de la voie après l'ajout séquentiel de chaque gène (Fig. 5a, Données supplémentaires 1, Fig. 8 à 12 supplémentaires). La co-infiltration de souches exprimant des enzymes pour l'ensemble de la voie produit un pic distinct à 531 m/z correspondant à la norme de strictosidine (Fig. 5b, c, Données supplémentaires 1, Fig. 11 supplémentaires). Cette configuration de voie produit 4,29 ± 2,00 µM de strictosidine, ce qui correspond à 0,23 ± 0,11 mg de strictosidine/g de tissu foliaire en poids sec (0,023 % DW). Le seul intermédiaire biosynthétique majeur dont l'accumulation a été observée était la loganine, ce qui suggère que la sécologanine synthase est une étape de goulot d'étranglement. Cela contraste avec les données précédentes suggérant que l'acide loganique O-méthyltransférase (LAMT), qui a une faible affinité pour le substrat (Km = 12, 5–14, 8 mM) 43, 44, pourrait être une étape limitant la vitesse des derniers stades de la voie sécoiridoïde. En plus de la strictosidine, l'expression transitoire de la voie complète produit également une plus petite quantité d'un composé (Fig. 5c, Fig. 11 supplémentaire) avec un déplacement de masse de 86 Da à partir de la strictosidine, suggérant qu'il pourrait s'agir d'un dérivé malonylé de la strictosidine produit par les acyltransférases endogènes de N. benthamiana. L'expression transitoire de la voie de la strictosidine sans GPPS ni MLPL (Fig. 5b, Données supplémentaires 1) confirme l'effet bénéfique de ces enzymes sur le rendement de la strictosidine. L'ajout de MLPL a augmenté la production de strictosidine> 60 fois tandis que la supplémentation en GPPS a amélioré le rendement d'environ 5 fois. La supplémentation en DXS n'a pas modifié la quantité de strictosidine produite (Fig. 1).

a Quantification des intermédiaires et du produit final strictosidine par analyse UPLC/MS. b L'absence de MLPL réduit la production de strictosidine> 60 fois tandis que la supplémentation en GPPS améliore le rendement d'environ 5 fois. c le chromatogramme ionique total du tissu foliaire infiltré par l'ensemble de la voie vers la strictosidine (y compris DXS, GPPS et MLPL). Le pic à 4,09 min de temps de rétention dans le chromatogramme d'ions totaux (TIC) et le chromatogramme d'ions extraits (EIC) à 531,2336 m/z correspond à un standard de strictosidine. ND, non détecté ; 7-DLH, hydroxylase de l'acide 7-désoxyloganique; LAMT, acide loganique O-méthyltransférase; SLS, sécologanine synthase ; TDC, tryptophane décarboxylase ; STR, strictosidine synthétase. Les valeurs et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard de n = 3 ou n = 6 répétitions biologiques (échantillons de feuilles indépendants).

Nous avons également infiltré la voie complète dans les lignées précédemment identifiées avec des mutations dans UGT94E7 (groupe A) ou NbUGT85A73 (groupe G), chacune ayant montré l'accumulation de moins de dérivés iridoïdes précoces. Cependant, nous n'avons observé aucun changement dans le rendement en strictosidine ou en sous-produits de strictosidine (Fig. 13 supplémentaire).

Pour comparer l'effet de la localisation des enzymes chloroplastiques et cytosoliques sur les rendements de production de 7-DLA et de strictosidine, nous avons ajouté (ou supprimé dans le cas de GPPS / GES) un peptide de transit à chaque enzyme (Fig. 6, Données supplémentaires 1). Pour améliorer le flux de précurseurs d'isoprénoïdes dans le cytosol, nous avons cherché à atténuer l'étape limitant la vitesse de la voie du mévalonate en co-infiltrant une 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase (tHMGR) tronquée de l'avoine, dont il a déjà été démontré qu'elle améliore les titres. du triterpénoïde β-amyrine chez N. benthamiana42. Lorsque toutes les enzymes étaient localisées dans le cytosol, le flux à travers la voie sécoiridoïde était minime (réduction d'environ 90 fois pour le 7-DLA), tandis que la localisation de toutes les enzymes de la voie dans le chloroplaste entraînait 5 fois moins de 7-DLA (Fig. 6a, Données supplémentaires 1). Les meilleurs rendements de 7-DLA (Fig. 6a, Données supplémentaires 1) et de strictosidine (Fig. 6b, Données supplémentaires 1) ont été obtenus avec la localisation chloroplastique de la voie précoce et la localisation cytosolique des étapes suivantes, qui imitaient le modèle de localisation native dans C. roseus. La production de 7-DLA dans le chloroplaste est peut-être limitée par la disponibilité de réductases P450 partenaires pour G8H et l'iridoïde oxydase (IO) ou de substrats à petites molécules tels que l'UDP-glucose pour 7-DLGT, cependant, toutes les divisions possibles des enzymes de la voie entre le le cytosol et le chloroplaste produisent toujours du 7-DLA indiquant que les intermédiaires de la voie peuvent traverser la membrane du chloroplaste.

La relocalisation des gènes de biosynthèse de la 7-DLA (a) et de la strictosidine (b) dans le cytosol (bleu) ou le chloroplaste (vert) diminue le rendement du produit. tHMGR, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase tronquée. Les valeurs et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard de n ≥ 3 répétitions biologiques (échantillons de feuilles indépendants).

Dans ce travail, nous avons cherché à améliorer la production d'intermédiaires biosynthétiques et de produits de la voie iridoïde et MIA chez N. benthamiana. Des études antérieures ont rapporté que, lorsque N. benthamiana est utilisé comme hôte pour l'expression hétérologue de produits naturels terpénoïdes, une variété de dérivés terpénoïdes s'accumule, limitant potentiellement l'utilisation de cette espèce comme châssis pour la production de certains types de molécules8,9, 10,11,12,13,14. Comme constaté dans des études précédentes, nous avons observé ici que les premiers intermédiaires de biosynthèse iridoïdes étaient fréquemment modifiés par l'ajout de sucres pentose et hexose suggérant l'implication des UGT de la famille 1 de N. benthamiana (Fig. 1 et tableau supplémentaire 1). De plus, alors qu'il est déjà connu que l'expression des gènes est affectée par l'agroinfiltration43, la transcriptomique comparative a révélé que l'expression de certaines UGT endogènes est encore modulée par l'expression de voies métaboliques monoterpéniques ou iridoïdes (tableau supplémentaire 2). Ceci indique que les plantes répondent non seulement à l'infiltration d'Agrobacterium, mais également à la présence d'enzymes et/ou de métabolites étrangers.

Bien que N. benthamiana n'accumule pas beaucoup de monoterpènes, ces UGT endogènes peuvent être impliqués dans la biosynthèse de métabolites décorés plus gros et sont ainsi capables d'agir de manière confuse sur les intermédiaires iridoïdes précoces. Alternativement, ils peuvent faire partie d'un mécanisme de détoxification xénobiotique pour se protéger contre les bioactifs produits par des agents pathogènes. Nous avons pensé qu'il était peu probable que ces enzymes soient des efforts essentiels et concentrés pour améliorer le châssis de N. benthamiana en identifiant et en éliminant l'activité de ces enzymes. Nous avons utilisé des outils moléculaires basés sur Cas9 pour introduire des mutations de perte de fonction dans 20 gènes cibles UGT (tableau 1 et figures supplémentaires 2 à 5). Nous avons utilisé deux approches : la production de plantes transgéniques exprimant de manière constitutive Cas9 avec plusieurs ARNsg45 et l'utilisation récemment décrite d'un vecteur viral pour exprimer de manière transitoire des ARNsg mobiles dans des plantes portant un transgène Cas938. Alors que nous avons pu récupérer des lignées avec des mutations dans la plupart ou toutes les lignées cibles en utilisant l'ancienne méthode, la méthode sgRNA mobile, bien que moins efficace, était moins laborieuse et pouvait plus facilement être mise à l'échelle pour étudier de nombreux gènes cibles.

Par rapport aux lignées témoins, les plantes présentant des mutations dans l'UGT du groupe A, NbUGT94E7, n'ont plus accumulé le pic supposément attribué à l'acide trihexosyl géranique (m/z 699,2713, [M + HCOOH-H]) (Fig. 3, Fig. 6 supplémentaires et 7). Cette UGT est également dépourvue du motif GSS proposé comme étant important pour définir la structure en boucle des monoglucosyltransférases37,39,40,41,42,43,44,46. Nous avons également identifié que, par rapport aux lignées témoins, quatre pics étaient diminués ou absents chez les plantes présentant des mutations dans le groupe G UGT, NbUGT85A73 (Fig. 3 et Fig. 6 et 7 supplémentaires). Cette UGT était précédemment signalée comme étant active sur le géraniol37. De manière surprenante, ces pics n'ont été éliminés que dans les plantes infiltrées avec toutes les enzymes de la voie nécessaires à la production de népétalactol, et sont toujours restés lorsque les gènes de la voie d'expression du géraniol étaient présents. Il est probable que l'hexosyl hydroxygeraniol (m/z 377,1817, [M + HCOOH-H]) et l'hexosyl hydroxycitronellal (m/z 379,1974, [M + HCOOH-H]) soient produits par glycosylation du 8-hydroxygeraniol et nécessitent donc l'expression de géraniol 8-oxydase. Cependant, on ne sait pas pourquoi l'accumulation de pentosyl hexosyl géraniol (m/z 493,2288, [M + HCOOH-H]) et d'acétyl dihexosyl géraniol (m/z 519,22425, [MH]) n'a été réduite que lorsque la voie étendue était infiltrée.

Notre approche fournit une preuve de concept pour l'application d'approches d'édition de gènes pour améliorer N. benthamiana en tant que châssis de bioproduction de petites molécules de type terpénoïde en réduisant l'accumulation de dérivés. Cependant, nous avons observé que les mutations d'UGT individuelles réduisaient chacune l'accumulation de pics mineurs. Pour obtenir un impact, la production de lignées avec des mutations dans plusieurs gènes peut être nécessaire pour avoir un impact considérable sur le rendement des métabolites d'intérêt. Nous avons également constaté que lorsque la voie est prolongée par la co-expression d'enzymes supplémentaires, moins de pics dérivés sont observés (Fig. 1, 4 et 5). Cela suggère que les enzymes de la voie ont une affinité élevée pour les substrats et, en particulier lorsqu'elles sont exprimées à partir de promoteurs puissants, sont très probablement capables de supplanter les enzymes endogènes pour les substrats. La strictosidine est une molécule polaire glycosylée qui est probablement séquestrée dans la vacuole pour le stockage et est moins sujette à la dérivatisation que ses précurseurs iridoïdes hydrophobes. En effet, lorsque la voie de la strictosidine était exprimée dans des lignées produisant moins de dérivés ou d'intermédiaires de la voie précoce, il n'y avait aucun changement de rendement par rapport à l'expression dans N. benthamiana de type sauvage (Fig. 13 supplémentaire).

Nous avons pu mettre en évidence la production de grandes quantités de strictosidine (0,23 ± 0,11 mg/g DW) à partir du métabolisme central dans un organisme photosynthétique. Nous avons également amélioré la production de strictosidine en améliorant l'étape de cyclisation clé nécessaire à la formation de népétalactol. Le genre végétal Nepeta L., familièrement connu sous le nom d'herbe à chat ou d'herbe à chat, utilise la première partie de la voie sécoiridoïde pour produire des népétalactones. Des travaux récents ont révélé que la production de cis-trans népétalactol est assistée par MLPL dans Nepeta41. L'expression hétérologue de MLPL à partir de N. mussinii pour aider à la cyclisation du produit énol réactif d'ISY a surmonté les goulots d'étranglement dans la voie sécoiridoïde (Fig. 4) et était essentielle pour permettre la production hétérologue de strictosidine dans N. benthamiana (Fig. 5). Le MLPL améliore de la même manière l'ingénierie métabolique des sécoiridoïdes dans des micro-organismes tels que la levure31. De plus, une cascade d'enzymes en un seul pot in vitro sans cellule comprenait du MLPL avec neuf autres enzymes de voie, des protéines accessoires et des enzymes de régénération de cofacteur pour produire ~ 1 g / L de népétalactone42.

La voie MIA chez C. roseus est hautement compartimentée dans les compartiments subcellulaires et les types de cellules. La première étape engagée est la synthèse du géraniol (GES), qui est localisée dans le chloroplaste des cellules de parenchyme associées au phloème interne47. Pour augmenter la disponibilité du substrat pour le GES, nous avons co-exprimé le GPPS de P. abies48 qui a également été utilisé par Miettinen et ses collègues14. L'expression de PaGPPS ciblé sur les chloroplastes a amélioré le rendement d'environ 5 fois (Fig. 5), conformément aux effets précédemment rapportés sur la production de géraniol13. Il convient de noter que PaGPPS est presque identique (Fig. 14 supplémentaire) à un GPPS de Picea glauca montré in vitro pour produire des niveaux plus élevés de limonène monoterpène par rapport à six autres séquences GPPS couramment utilisées dans l'ingénierie métabolique des terpènes49. Nous avons également co-exprimé DXS de C. roseus. Fait intéressant, le CrDXS a eu relativement peu d'effet sur le rendement en strictosidine contrairement aux effets précédemment rapportés du DXS sur la production de diterpénoïdes10,50.

Des efforts récents pour concevoir des voies métaboliques ont trouvé des avantages en modifiant la compartimentation des enzymes de la voie13,51. Par exemple, la voie de production de la dhurrine, un glucoside cyanogène, a été déplacée vers le chloroplaste de Nicotiana tabacum où la ferrédoxine, réduite via la chaîne de transport d'électrons photosynthétique, peut servir de donneur d'électrons efficace aux deux cytochromes P450 (CYP) de la voie52. De plus, la localisation des enzymes codant pour les dernières étapes de la voie de l'artémisinine vers le chloroplaste chez N. tabacum a produit des niveaux plus élevés d'artémisinine (800 µg/g DW)53 et d'acide artémisinique (~1200 µg/g DW)54 par rapport à la localisation dans le cytosol (6,8 µg/g DW artémisinine)55. Cette augmentation est peut-être due à l'isolement des métabolites du cytosol où ils peuvent à la fois avoir un impact sur la viabilité et être exposés à une dérivatisation indésirable par des glycosyltransférases endogènes11,12,56. La production d'indican halogéné57 et de vanilline58 chez N. benthamiana a également bénéficié de la localisation des chloroplastes. En revanche, un rapport récent a révélé que la production de diterpénoïdes (généralement synthétisés dans le chloroplaste) était considérablement améliorée en cooptant la voie du mévalonate cytosolique pour produire du GGPP plutôt que la voie MEP du chloroplaste59.

Dans cette étude, nous avons constaté que la configuration optimale pour reconstruire la voie de la strictosidine dans les feuilles de N. benthamiana consiste à faire correspondre le schéma de localisation de C. roseus qui utilise la voie MEP du chloroplaste pour que les précurseurs isoprénoïdes produisent du géraniol, puis localisent les enzymes de la voie restantes dans le cytosol (Fig. 4). Nous émettons l'hypothèse que la production de monoterpènes dans le cytosol est limitée puisque le GPP (10 carbones) produit par GPPS est également le substrat de la farnésylpyrophosphate synthase (FPPS) de N. benthamiana, qui produit le farnésylpyrophosphate (FPP) (15 carbones). Cette hypothèse est soutenue par des données suggérant que les quatre copies de NbFPPS sont régulées positivement pour produire des phytostérols et des phytoalexines sesquiterpénoïdes en réponse à Phytophthora infestans60. A. tumefaciens provoque également un remodelage transcriptionnel généralisé lorsqu'il est infiltré dans N. benthamiana35. Cette compétition entre GES et FPPS pourrait également expliquer les niveaux plus élevés de géraniol et de dérivés de géraniol dans le plaste rapportés précédemment13. Les efforts futurs pour inactiver conditionnellement NbFPPS pendant la production hétérologue pourraient permettre une stratégie d'ingénierie métabolique qui pourrait tirer parti à la fois de la voie plastidique et cytosolique de la production de géraniol.

Chez C. roseus, le géraniol diffuse ou est transporté du plaste dans le cytosol pour réagir avec le G8H, qui est attaché à l'extérieur de la membrane du RE. Les étapes suivantes (G8H en acide désoxyloganique hydroxylase (7-DLH)) sont actives dans le cytosol des cellules de parenchyme associées au phloème avec deux CYP (G8H et IO) également ancrés à la membrane du RE14. L'acide loganique est ensuite transporté par NPF2.4/5/661 vers les cellules épidermiques où quatre autres enzymes (LAMT en strictosidine synthase (STR)) produisent la strictosidine62,63. La tryptamine et la sécologanine sont importées dans la vacuole, où la strictosidine est synthétisée et accumulée avec exportation de strictosidine médiée par le transporteur NPF2.964. Ainsi, quatre voies CYP (G8H, IO, 7-DLH et sécologanine synthase) s'interfacent probablement avec les CYP réductases endogènes de N. benthamiana pour le transfert d'électrons du NADPH vers les CYP. Il est possible que les CYP réductases nécessaires soient moins abondantes dans le chloroplaste et limitent ainsi l'accumulation de strictosidine dans ce compartiment. Il est également possible que les CYP450 soient mal ancrés à la membrane ou qu'un pH stromal plus élevé du chloroplaste (~ 8,0) 65 inhibe l'activité enzymatique par rapport au cytosol (pH ~ 7,0). Nous avons également considéré l'absence d'un cofacteur supplémentaire pour LAMT, la S-adénosylméthionine (SAM) pour expliquer les faibles niveaux de production de strictosidine (par rapport au 7-DLA) dans le chloroplaste. Cependant, cette petite molécule est connue pour être activement transportée dans le plaste66 et est un substrat essentiel pour la ChlM (Mg-protoporphyrine IX méthyltransférase) impliquée dans la biosynthèse de la chlorophylle au sein du chloroplaste.

La production de strictosidine in planta ouvre de nouvelles voies pour produire une multitude de produits MIA par synthèse biologique. Bien que le métabolisme endogène de cette espèce soit préjudiciable à l'accumulation de monoterpènes, il permet l'accumulation de molécules complexes. En particulier à mesure que de nouvelles voies de biosynthèse pour des MIA supplémentaires sont découvertes (par exemple, le composé anti-addictif ibogaïne67, la quinine antipaludique68), la possibilité de coupler ce travail de manière plug-and-play avec des modules de biosynthèse en aval est une perspective passionnante pour les produits naturels. la synthèse.

Les vecteurs binaires pour l'expression transitoire médiée par Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration) ont été soit assemblés en clonant des séquences codantes amplifiées à partir de l'ADNc de C. roseus dans le vecteur pEAQ-HT-DEST1 (GenBank GQ497235, tableau supplémentaire 4)69, soit assemblés en constructions d'expression à l'aide de la plante boîte à outils de clonage modulaire (MoClo)70. Pour ce dernier, les séquences codantes ont été soit synthétisées (Twist Bioscience, San Francisco, CA) en supprimant toute séquence peptidique de transit du chloroplaste natif ainsi que toutes les instances de sites de reconnaissance BpiI, BsaI, BsmBI et SapI par l'introduction d'une mutation synonyme ou amplifiée à partir de C ADNc de .roseus par PCR avec des surplombs contenant des sites de reconnaissance BpiI (BbsI). Les amplicons ont été clonés dans pUAP1 (Addgene # 63674) comme décrit précédemment71, ce qui a donné des parties de niveau 0 (Addgene # 177019 - 177032) flanquées d'une paire inversée de sites de reconnaissance BsaI qui produisent des surplombs compatibles avec la norme d'assemblage phytobrick72 (tableau supplémentaire 5). Ces parties de niveau 0 ont été assemblées en accepteurs de niveau 1 dans une réaction de clonage en une étape71 avec des parties de niveau 0 codant pour le promoteur CaMV 35s (CaMV35s) et 5' UTR du virus de la mosaïque du tabac (TMV) et, si nécessaire, un transit de chloroplaste synthétique. séquence peptidique (tableau supplémentaire 6) pour modifier la localisation subcellulaire.

Les plantes de N. benthamiana ont été cultivées dans une pièce à environnement contrôlé avec 16 heures de lumière, 8 heures d'obscurité avec une pièce à 22 ° C, 80 % d'humidité et une intensité lumineuse d'environ 200 µmol/m2/s. Les électrocompétents A. tumefaciens GV3101 (vecteurs MoClo) ou LBA4404 (vecteurs pEAQ) ont été transformés avec le plasmide binaire codant pour le gène d'intérêt et une colonie individuelle a été utilisée pour inoculer un milieu LB liquide contenant des antibiotiques 50 μg/mL de rifampicine, 20 μg/mL de gentamicine , et 100 μg/mL de carbénicilline (vecteurs MoClo) ou 50 μg/mL de rifampicine, 100 μg/mL de streptomycine et 50 μg/mL de kanamycine (vecteurs pEAQ). Les cultures saturées d'une nuit ont été centrifugées à 3400 × g pendant 30 min à température ambiante et les cellules ont été remises en suspension dans un milieu d'infiltration (10 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) pH 5,7, 10 mM MgCl2, 200 µM 3′,5 ′-Diméthoxy-4′-hydroxyacétophénone (acétosyringone)) et incubé à température ambiante pendant 2-3 h avec agitation lente. Toutes les cultures remises en suspension ont été diluées à 0,8 OD600nm (MoClo) ou 0,5 OD600nm (pEAQ) et mélangées dans des rapports égaux comme dicté par les conditions expérimentales. Pour les vecteurs MoClo, une souche distincte d'A. tumefaciens codant pour un gène exprimant le suppresseur P19 du silençage génique du Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) dont l'augmentation de l'expression hétérologue a été précédemment démontrée a été incluse dans chaque infiltration69. Des plantes saines (âgées de 29 à 37 jours) avec 3 à 4 vraies feuilles complètement développées ont été infiltrées sur le côté abaxial de la feuille à l'aide d'une seringue sans aiguille de 1 ml et cultivées pendant cinq jours dans une chambre de croissance de plantes MLR-352-PE (Panasonic Healthcare Co, Oizumi-Machi, Japon) avec 16 h de lumière, 8 h d'obscurité à 22 °C et une intensité lumineuse de 120 à 180 µmol/m2/s. Tous les composés chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cinq jours après l'infiltration, 100 à 300 mg de tissu foliaire de N. benthamiana infiltré ont été collectés dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml et congelés instantanément dans de l'azote liquide. Le tissu foliaire a été lyophilisé pendant une nuit à l'aide d'un lyophilisateur VirTis BenchTop SLC (SP Industries, Stone Ridge NY, États-Unis) réglé sur -49 ° C et 300 mTorr. Les échantillons ont ensuite été broyés en poudre à l'aide d'une bille de carbure de tungstène de 3 mm (Qiagen Cat. No. / ID : 69997) sur un TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Allemagne) réglé sur 20 Hz pendant 20 secondes. Le tissu foliaire lyophilisé a été extrait avec 70 % de méthanol + 0,1 % d'acide formique (1:100, wv). Le solvant contenait 10 µM d'harpagoside (Extrasynthese, Genay, France) comme étalon interne. Les extractions ont été réalisées à température ambiante pendant 1 h, avec 10 min de sonication et 50 min d'agitation constante. Les échantillons ont été centrifugés à 17 000 × g pendant 10 min pour séparer les débris et filtrés à travers des filtres à disque en PTFE de 0, 2 µm avant l'analyse par chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse (UPLC / MS).

L'analyse UPLC/MS a été réalisée sur un spectromètre de masse Impact II qTOF (Bruker) couplé à un système chromatographique Elute UPLC (Bruker). La séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne Phenomenex Kinetex XB-C18 (100 × 2,10 mm, granulométrie 2,6 μm) maintenue à 40 °C et le système de solvant binaire était composé du solvant A (H2O + 0,1 % d'acide formique) et du solvant B ( acétonitrile). Le débit était de 600 μL/min. La colonne a été équilibrée avec 99 % A et 1 % B. Au cours de la première minute de chromatographie, le solvant B a atteint 5 %. Puis un gradient linéaire de 5% B à 40% B en 5 min a permis la séparation des composés d'intérêt. La colonne a ensuite été lavée à 100 % de B pendant 1,5 min et rééquilibrée à 1 % de B. Le volume d'injection était de 2 μL. La spectrométrie de masse a été réalisée à la fois en mode ions positifs et négatifs avec une plage de balayage m/z 100–1000. Le spectromètre de masse a été calibré en utilisant des adduits de formiate de sodium. Les réglages de la source étaient les suivants : tension capillaire 3,5 kV, nébuliseur 2,5 Bar, gaz sec 11,0 L/min, température sèche 250 °C. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel Bruker Data Analysis. La quantification de l'acide 7-désoxyloganique (7-DLA), de la loganine, de l'acide loganique et de la strictosidine était basée sur des courbes d'étalonnage générées à l'aide de composés purs. La loganine et l'acide loganique ont été achetés chez Sigma. L'acide 7-désoxyloganique et la strictosidine ont été synthétisés comme décrit précédemment73,74. Les étalons ont été dilués dans 70 % de méthanol + 0,1 % d'acide formique pour donner neuf étalons avec des concentrations comprises entre 40 nM et 10 µM. Une réponse linéaire a été observée pour tous les composés dans cette gamme de concentrations (R2 > 0,993). L'identification putative des métabolites était basée sur l'acquisition de données de spectrométrie de masse à haute résolution pour déterminer la composition élémentaire la mieux adaptée à l'aide du logiciel d'analyse de données (Bruker).

Des expériences d'agroinfiltration ont été réalisées comme décrit ci-dessus avec quatre ensembles de vecteurs pEAQ : (1) géraniol faible (GFP, CrGES), (2) géraniol élevé (GFP, CrDXS, CrGGPPS.LSU, CrGES), (3) népétalactol (GFP, CrDXS , CrGGPPS.LSU, CrGES, CrG8H, Cr8HGO, CrISY), et (4) un contrôle d'infiltration (GFP uniquement) (tableau supplémentaire 7). Des tissus foliaires provenant de trois répliques biologiques de chaque condition et d'un témoin infiltré factice ont été collectés cinq jours après l'infiltration et congelés instantanément dans de l'azote liquide. L'ARN total a été isolé à l'aide du kit RNeasy plant mini (Qiagen) avec un traitement à la DNase I recombinante (Roche). Les bibliothèques ont été construites sur une station de travail Sciclone® G3 NGSx (PerkinElmer, Waltham, MA) en utilisant le protocole TruSeq RNA v2 (Illumina 15026495 Rev.F). La qualité de l'ARN a été évaluée à l'aide du kit d'analyse d'ARN Quant-iT™ (Life technologies/Invitrogen Q-33140). 1 µg d'ARN a été purifié pour extraire l'ARNm polyadénylé à l'aide de billes de biotine, fragmenté et amorcé avec des hexamères aléatoires pour produire l'ADNc du premier brin, suivi d'une synthèse du second brin pour produire l'ADNc ds. Les extrémités des échantillons ont été émoussées et les adaptateurs à queue en A et d'indexation avec les surplombs en T correspondants ont été ligaturés. Les produits ligaturés ont été sélectionnés par taille et les adaptateurs non ligaturés ont été retirés à l'aide de billes XP (Beckman Coulter A63880). Les échantillons ont été amplifiés avec un cocktail d'amorces PCR sur les adaptateurs. La taille de l'insert des bibliothèques a été vérifiée à l'aide des réactifs LabChipGX (PerkinElmer 5067–4626) et DNA High Sensitivity DNA (PerkinElmer CLS760672). Des quantités équimolaires de chaque bibliothèque ont été regroupées, cinq bibliothèques par pool, et séquencées sur une voie d'un HiSeq 2500 générant des lectures appariées de 100 paires de bases. L'analyse des données a été effectuée à l'aide d'une interface Web Galaxy (https://galaxy.earlham.ac.uk)75. Le projet d'assemblage du génome de N. benthamiana v0.5 http://benthgenome.qut.edu.au/76 a été étendu pour inclure le génome et les plasmides d'Agrobacterium C58 (Genbank AE007869.2, AE007870.2, AE007871.2 et AE007872 .2) ainsi que les vecteurs pEAQ utilisés pour l'infiltration (tableau complémentaire 4). Toutes les lectures courtes de RNA-seq ont été cartographiées sur le génome étendu à l'aide des paramètres par défaut hisat2 v2.1.0. Les transcriptions assemblées ont été générées à l'aide de Stringtie v1.3.3.1. Les transcriptions de n = 15 échantillons expérimentaux ont été consolidées à l'aide de Stringtie merge v1.3.3. Toutes les lectures courtes ont de nouveau été alignées sur le génome élargi (cette fois avec le transcriptome fusionné comme référence) en utilisant hisat2 v2.1.0. Des tables d'expressions différentielles ont été générées à l'aide de DESeq2 v2.11.40.1. Les transcriptions du transcriptome fusionné ont été traduites à l'aide d'un transdécodeur et les séquences codantes les plus longues annotées à l'aide de phmmer v3.1v2 avec la base de données de protéines Swiss-Prot (consultée en mai 2018) comme référence.

Les transcrits de N. benthamiana codant pour les séquences annotées en tant que glycosyltransférases de la famille 1 (GT1, famille de protéines (Pfam) PF0201 ou PF3033) ont été analysés, ce qui a donné 77 séquences> 327 acides aminés et incluant une boîte intacte de glycosyltransférase de produit secondaire végétal (PSPG). Les séquences protéiques de 107 UGT d'Arabidopsis thaliana ont été obtenues à partir du site A. thaliana cytochrome P450, cytochrome b5, P450 réductase, b-glucosidase et glycosyltransférase (http://www.p450.kvl.dk) comme décrit33. 9 séquences UGT supplémentaires précédemment signalées comme ayant une activité sur le géraniol ou d'autres substrats iridoïdes d'Actinidia deliciosa (kiwi)77, Camellia sinensis (thé)78, C. roseus79, Gardenia jasminoides (jasmin du Cap)80, Sorghum bicolor81, Vitis vinifera (raisin )82,83 ont également été inclus. Les séquences et les numéros d'accès sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 8. Les 193 séquences ont été alignées à l'aide de MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) et un arbre phylogénétique avec 100 bootstraps a été généré à l'aide de la version RAxML 8.2.1184 du programme Geneious. Les arbres phylogénétiques ont été visualisés à l'aide de l'arbre de vie interactif (iTOL)85.

Des vecteurs binaires exprimant Cas9 et des ARN à guide unique (ARNsg) pour les cibles souhaitées ont été assemblés à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire des plantes71 comme décrit précédemment45. En bref, des amorces codant pour l'espaceur sgRNA souhaité (tableau supplémentaire 9) ont été utilisées pour amplifier par PCR l'échafaudage d'extension de tige sgRNA rapporté par Chen et ses collègues86. L'amplicon PCR résultant a été assemblé avec une partie de niveau 0 codant soit un promoteur Arabidopsis U6–26 (AtU6–26 Addgene#68261) soit un promoteur N. benthamiana U6 (NbU6-1 Addgene#185623 et NbU6-2 Addgene#185624) ( Tableau supplémentaire 9). Les promoteurs U6 de N. benthamiana ont été identifiés par homologie de séquence avec Arabidopsis U6–26 et l'efficacité a été confirmée par infiltration transitoire comme décrit précédemment45. Les constructions de niveau 1 résultantes ont été assemblées avec des gènes synthétiques conférant une résistance à la kanamycine et pour l'expression constitutive de Cas9 (Fig. 15 supplémentaire). L'efficacité des sgARN a été confirmée par une infiltration transitoire comme décrit précédemment45. Les constructions résultantes ont été transformées dans la souche AGL1 d'A. tumefaciens hypervirulente pour la transformation des plantes. Une colonie individuelle a été utilisée pour inoculer 10 ml de milieu LB avec des antibiotiques (50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine). Les cultures saturées d'une nuit ont été centrifugées à 3000 × g pendant 10 min à température ambiante et les cellules ont été remises en suspension dans 10 ml de milieu MS avec 100 μM d'acétosyringone et la densité optique OD600 ajustée à 0, 6-0, 8. N. benthamiana a été transformé comme indiqué précédemment87 avec de légères modifications. Les jeunes feuilles ont été récoltées sur des plantes non fleuries âgées de 4 semaines et stérilisées en surface. Des carrés de 1 à 2 cm ont été inoculés avec Agrobacterium pendant cinq minutes à température ambiante, séchés sur du papier filtre stérile et placés face abaxiale vers le bas sur un milieu de co-culture pH 5,8 contenant du sel basal MS88, des vitamines B5 de Gamborg89, 3 % (p/v) saccharose, 0,59 g/L de MES hydraté, 6 g/L d'agarose, 6-benzylaminopurine (BAP, 1,0 mg/L) et acide naphtalèneacétique (NAA, 0,1 mg/L). Les explants ont été co-cultivés pendant 3 jours sous une lumière fluorescente blanche (16 h de lumière/8 h d'obscurité) à 22 ± 2 oC puis transférés dans un milieu de sélection contenant des sels basaux de MS, des vitamines B5 de Gamborg, 3 % (p/v) de saccharose, 0,59 g/L MES hydrate, 6 g/L Agargel, 6-Benzylaminopurine (BAP, 1,0 mg/L) et acide naphtalèneacétique (NAA, 0,1 mg/L), 100 mg/L kanamycine et 320 mg/L ticarcilline. Les explants ont été sous-cultivés sur du milieu de sélection frais à des intervalles de 14 jours. Les pousses transgéniques putatives ont été cultivées sur des milieux d'enracinement contenant des sels de MS avec des vitamines (demi-force), additionnés de 1 mg/L d'acide indole-3-butyrique, 0,5 % de saccharose, 0,3 % de Gelrite, 100 mg/L de kanamycine et 320 mg/L de ticarcilline . Les plantules ont été transférées dans des blocs de tourbe stérile (Jiffy7) dans des récipients MagentaTM (Sigma), avant d'être transplantées dans un compost à base de tourbe (90 % de tourbe, 10 % de gravier, 4 kg/m3 de calcaire dolomitique, 0,75 kg/m3 d'engrais composé (PG Mix ™), 1,5 kg/m3 d'engrais à libération contrôlée (Osmocote Bloom)) et transféré dans une serre.

Un vecteur plasmidique TRV2 SPDK3888 (Addgene #149276) a été reçu avec reconnaissance de Savithramma Dinesh-Kumar et Dan Voytas. Ceci a été modifié en ajoutant des sites de restriction AarI et une cassette lacZ pour la sélection produisant pEPQD0KN0750 (Addgene #185627). Les séquences d'espacement pour les cibles sélectionnées ont été incorporées dans pEPQD0KN0750 par assemblage Golden Gate dans les sites AarI comme décrit précédemment38 (tableau supplémentaire 10). Les constructions ont été transformées en A. tumefaciens GV3101 et une colonie individuelle a été utilisée pour inoculer un milieu LB contenant 50 μg/mL de rifampicine, 20 μg/mL de gentamicine et 50 μg/mL de kanamycine et cultivée pendant une nuit sous agitation à 28 °C. Les cultures saturées ont été centrifugées et remises en suspension dans un milieu d'infiltration comme décrit ci-dessus, sauf que les cultures ont été diluées à 0,3 OD600nm et que les souches d'Agrobacterium ont été mélangées en proportions égales avec une souche contenant pTRV1 (Addgene #148968). Des graines de plantes transgéniques de N. benthamiana exprimant de manière constitutive Cas9 (Cas9 Benthe 193.22 T5 homozygote) ont été reçues avec gratitude de Dan Voytas et cultivées pendant 6 semaines dans une serre à 22 ± 2 °C. Les plantes ont été infiltrées comme décrit ci-dessus et laissées pousser pendant 13 semaines avant que des échantillons de tissu foliaire ne soient prélevés sur deux tiges différentes (désignées A et B).

Des échantillons de 40 à 60 mg de tissu foliaire ont été prélevés sur des plantes T0 générées par une transformation stable médiée par l'agrobactérie ou sur des feuilles prélevées sur deux tiges de plantes infiltrées de virus à ARN exprimant des sgARN mobiles. L'ADN génomique a été isolé comme décrit précédemment45. Les locus cibles ont été amplifiés à l'aide d'une polymérase de relecture (Q5® High-Fidelity DNA Polymerase, New England Biolabs, Ipswich, MA) et d'amorces flanquant les sites cibles (tableau supplémentaire 11). Les amplicons ont été séquencés par séquençage Sanger (Eurofins, Luxembourg). Les amplicons avec plusieurs pics suggérant la présence d'un chimérisme génétique, de mutations hétérozygotes ou bialléliques, ont été résolus en clonant des amplicons dans Zero Blunt™ TOPO™ (Thermo Fisher, Waltham, MA) ou pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI) suivi du séquençage des plasmides isolés de 10 à 15 colonies. Pour les plantes générées par transformation stable médiée par agrobacterium, le nombre de copies d'ADN-T des plantes T0 a été estimé par ddPCR comme décrit précédemment90 en utilisant des amorces à nptII et le gène de référence à copie unique Rdr191. Les graines T1 de plantes à copie unique présentant des mutations homozygotes, hétérozygotes ou bialléliques aux emplacements cibles ont été collectées et cultivées pour des analyses ultérieures. Pour les plantes générées à l'aide de virus à ARN et d'ARNsg mobiles, les graines (désignées par E1) ont été récoltées à partir de gousses individuelles à l'extrémité distale des tiges dans lesquelles des mutations ont été détectées. T1 et E1 ont été cultivés et le génotype de chaque locus cible a été confirmé comme ci-dessus.

Un minimum de n = 3 réplicats biologiques ont été utilisés pour l'analyse du transcriptome, l'évaluation des pics dérivés dans les plantes mutées et la quantification du rendement. Des expériences clés, y compris la quantification de l'acide 7-désoxyloganique (7-DLA) et de la strictosidine, ont été répétées de telle sorte que n = 6 ou n = 11. Les changements de rendement ont été analysés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec Tukey HSD post-hoc. Aucune donnée n'a été exclue. La disposition des échantillons agroinfiltrés dans les feuilles a été randomisée entre les feuilles et entre les plantes au sein d'une expérience donnée. Pour l'identification des dérivés et la quantification des produits métabolites, la conception expérimentale, l'infiltration des feuilles et la collecte d'échantillons ont été réalisées par un chercheur et les échantillons ont été analysés à l'aveugle par un autre chercheur.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Des séquences et des échantillons d'ADN de plasmides ont été déposés chez Addgene (#177019 - #177092). Les données du transcriptome ont été déposées dans la base de données NCBI Sequence Read Archive sous le projet ID PRJNA841421. Les données sources numériques pour tous les graphiques sont fournies dans les données supplémentaires 1.

Patron, NJ Au-delà du naturel : expansions synthétiques de la forme et de la fonction botaniques. N. Phytol. 227, 295–310 (2020).

Article Google Scholar

Stephenson, MJ, Reed, J., Patron, NJ, Lomonossoff, GP et Osbourn, A. 6.11 - Tabac technique pour la production de produits naturels végétaux. Dans Comprehensive Natural Products III (eds. Liu, H.-W. (ben) & Begley, TP) 244–262 (Elsevier, 2020).

Bally, J. et al. L'essor et l'essor de Nicotiana benthamiana : une plante pour toutes les raisons. Annu. Rev. Phytopathol. 56, 405–426 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Goodin, MM, Zaitlin, D., Naidu, RA et Lommel, SA Nicotiana benthamiana : son histoire et son avenir en tant que modèle pour les interactions plante-pathogène. Mol. Usine. Interaction microbienne. 21, 1015-1026 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lomonossoff, GP & D'Aoust, MA Produits biopharmaceutiques produits par les plantes : un cas de développements techniques entraînant le déploiement clinique. Sciences 353, 1237-1240 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Reed, J. et al. Une plate-forme de biologie synthétique translationnelle pour un accès rapide à des quantités à l'échelle du gramme de nouvelles molécules de type médicament. Métab. Ing. 42, 185-193 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schultz, BJ, Kim, SY, Lau, W. & Sattely, ES Biosynthèse totale pour la production à l'échelle du milligramme d'intermédiaires étoposide dans un châssis de plante. Confiture. Chim. Soc. 141, 19231–19235 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q. et al. Élucidation et reconstitution in planta de la voie de biosynthèse des parthénolides. Métab. Ing. 23, 145-153 (2014).

Article PubMed CAS Google Scholar

Liu, Q. et al. Reconstitution de la voie de biosynthèse des costunolides chez la levure et Nicotiana benthamiana. PLoS One 6, e23255 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brückner, K. & Tissier, A. Production de diterpènes de haut niveau par expression transitoire chez Nicotiana benthamiana. Méthodes végétales 9, 46 (2013).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

van Herpen, TWJM et al. Nicotiana benthamiana comme plateforme de production de précurseurs de l'artémisinine. PLoS One 5, e14222 (2010).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ting, H.-M. et coll. Le chémotype du métabolite de Nicotiana benthamiana exprimant de manière transitoire les gènes de la voie de biosynthèse de l'artémisinine est fonction du type de CYP71AV1 et du dosage relatif des gènes. N. Phytol. 199, 352–366 (2013).

Article CAS Google Scholar

Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H. & Van Der Krol, A. Potentiel de biosynthèse des monoterpènes des compartiments subcellulaires des plantes. N. Phytol. 209, 679–690 (2016).

Article CAS Google Scholar

Miettinen, K. et al. La voie seco-iridoïde de Catharanthus roseus. Nat. Commun. 5, 3606 (2014).

Khakimov, B. et al. Identification et organisation du génome des gènes de la voie des saponines d'une crucifère sauvage, et leur utilisation pour la production transitoire de saponines chez Nicotiana benthamiana. Plant J. 84, 478–490 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lau, W. & Sattely, ES Six enzymes de mayapple qui complètent la voie de biosynthèse vers l'aglycone étoposide. Sciences 349, 1224-1228 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mikkelsen, MD, Olsen, CE et Halkier, BA Production de glucoraphanine anticancéreuse dans le tabac. Mol. Usine 3, 751–759 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Irmisch, S. et al. Gènes de biosynthèse des flavonols et leur utilisation dans l'ingénierie du métabolite antidiabétique végétal montbretin A. Plant Physiol. 180, 1277-1290 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mateos-Fernández, R. et al. Production de phéromones sexuelles volatiles chez les plantes transgéniques de Nicotiana benthamiana. BioDesign Res. 2021, 9891082 (2021).

Article Google Scholar

Pan, Q., Mustafa, NR, Tang, K., Choi, YH & Verpoorte, R. La biosynthèse des alcaloïdes indoles monoterpénoïdes et sa régulation chez Catharanthus roseus: une revue de la littérature des gènes aux métabolites. Phytochem. Rév. 15, 221–250 (2016).

Article CAS Google Scholar

van Der Heijden, R., Jacobs, DI, Snoeijer, W., Hallard, D. & Verpoorte, R. Les alcaloïdes de Catharanthus : pharmacognosie et biotechnologie. Courant. Méd. Chim. 11, 607–628 (2004).

Article Google Scholar

Saiman, MZ et al. Altération métabolique des cultures de suspension cellulaire de Catharanthus roseus surexprimant la géraniol synthase dans les plastes ou le cytosol. Culture d'organes de tissus de cellules végétales. 134, 41–53 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, K. et al. Le silençage génique amélioré induit par le virus permet la découverte d'un gène de serpentine synthase chez Catharanthus roseus. Physique Végétale. 187, 846–857 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q. et al. Développement d'un système efficace de régénération et de transformation de Catharanthus roseus utilisant des agrobacterium tumefaciens et des hypocotyles comme explants. BMC Biotechnol. 12, 34 (2012).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ishikawa, H. et al. Synthèse totale de vinblastine, vincristine, produits naturels apparentés et analogues structuraux clés. Confiture. Chim. Soc. 131, 4904–4916 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuboyama, T., Yokoshima, S., Tokuyama, H. & Fukuyama, T. Synthèse totale stéréocontrôlée de (+)-vincristine. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 101, 11966–11970 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caputi, L. et al. Enzymes manquantes dans la biosynthèse du médicament anticancéreux vinblastine chez la pervenche de Madagascar. Sciences 360, 1235-1239 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Qu, Y. et al. Solution de la voie en plusieurs étapes pour l'assemblage des alcaloïdes indoliques monoterpénoïdes corynanthean, strychnos, iboga et aspidosperma à partir de 19E-geissoschizine. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 115, 3180–3185 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Billingsley, JM et al. Ingénierie de la sélectivité biocatalytique de la production d'iridoïdes chez Saccharomyces cerevisiae. Métab. Ing. 44, 117-125 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, S., Clastre, M., Courdavault, V. & O'Connor, SE Production de novo de la strictosidine alcaloïde d'origine végétale dans la levure. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 112, 3205–3210 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, T. et al. Construction de voies de biosynthèse de l'ajmalicine et de la sanguinarine de novo en utilisant des sites d'intégration stables dans la levure. Biotechnol. Bioeng. 119, 1314-1326 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hofer, R. et al. Activités géraniol hydroxylase et hydroxygéraniol oxydase de la famille CYP76 des enzymes du cytochrome P450 et potentiel d'ingénierie des premières étapes de la voie (seco)iridoïde. Métab. Ing. 20, 221-232 (2013).

Article PubMed CAS Google Scholar

Caputi, L., Malnoy, M., Goremykin, V., Nikiforova, S. & Martens, S. Une reconstruction phylogénétique à l'échelle du génome des UDP-glycosyltransférases de la famille 1 a révélé l'expansion de la famille lors de l'adaptation des plantes à la vie sur atterrir. Plante J. 69, 1030-1042 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang, M. et al. L'analyse fonctionnelle et informatique permet la prédiction de l'activité de la glycosyltransférase. Nat. Chim. Biol. 14, 1109-1117 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grosse-Holz, F. et al. Le transcriptome, le protéome extracellulaire et le sécrétome actif de Nicotiana benthamiana agroinfiltré découvrent un répertoire de protéases vaste et diversifié. Biotechnologie Végétale. J. 16, 1068-1084 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Caputi, L., Lim, E.-K. & Bowles, DJ Découverte de nouveaux biocatalyseurs pour la glycosylation des échafaudages terpénoïdes. Chimie 14, 6656–6662 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sun, G. et al. La glucosylation de la phytoalexine N-féruloyl tyramine module les niveaux de métabolites sensibles aux agents pathogènes chez Nicotiana benthamiana. Plant J. 100, 20–37 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ellison, EE et al. Édition multiplexée de gènes héréditaires à l'aide de virus à ARN et d'ARN mobiles à guide unique. Nat. Plantes 6, 620–624 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Geu-Flores, F. et al. Une voie alternative aux terpènes cycliques par cyclisation réductrice dans la biosynthèse des iridoïdes. Nature 492, 138-142 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lichman, BR et al. Activation et cyclisation découplées dans la biosynthèse réductrice des terpénoïdes de la cataire. Nat. Chim. Biol. 15, 71–79 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lichman, BR et al. Les origines évolutives de la népétalactone qui attire les chats dans l'herbe à chat. Sci. Adv. 6, eaba0721 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bat-Erdene, U. et al. Biosynthèse totale acellulaire de produits naturels de terpènes végétaux à l'aide d'un système de régénération de cofacteur orthogonal. ACS Catal. 11, 9898–9903 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Madyastha, KM, Guarnaccia, R., Baxter, C. & Coscia, CJ S-adénosyl-L-méthionine : acide loganique méthyltransférase. Une enzyme carboxyl-alkylante de Vinca rosea. J. Biol. Chim. 248, 2497-2501 (1973).

Article CAS PubMed Google Scholar

Murata, J., Roepke, J., Gordon, H. & De Luca, V. L'épiderme foliaire de Catharanthus roseus révèle sa spécialisation biochimique. Cellule végétale 20, 524–542 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dudley, QM, Raitskin, O. & Patron, NJ Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Plants. Méthodes Mol. Biol. 2379, 1–26 (2022).

Article PubMed Google Scholar

Huang, F.-C. et coll. L'analyse structurelle et fonctionnelle de l'UGT92G6 suggère un lien évolutif entre les transférases formant des glycosides mono- et disaccharidiques. Cellule végétale Physiol. 59, 857–870 (2018).

Google Scholar PubMed

Simkin, AJ et al. Caractérisation de la géraniol synthase plastidiale de la pervenche de Madagascar qui initie la branche monoterpénoïde de la voie alcaloïde dans le parenchyme interne associé au phloème. Phytochimie 85, 36–43 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Schmidt, A. et al. Une géranyl et géranylgéranyl diphosphate synthase bifonctionnelle est impliquée dans la formation d'oléorésine terpénique chez Picea abies. Physique Végétale. 152, 639–655 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dudley, QM, Karim, AS, Nash, CJ & Jewett, MC Prototypage in vitro de la biosynthèse du limonène à l'aide de la synthèse protéique acellulaire. Métab. Ing. 61, 251-260 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, J. et al. Ingénierie métabolique chloroplastique couplée à l'amélioration du pool d'isoprénoïdes pour la biosynthèse des taxanes engagés chez Nicotiana benthamiana. Nat. Commun. 10, 4850 (2019).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Jensen, PE & Scharff, LB Ingénierie des plastes pour optimiser la production de métabolites et de protéines de grande valeur. Courant. Avis. Biotechnol. 59, 8–15 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gnanasekaran, T. et al. Transfert de la voie de la dhurrine dépendante du cytochrome P450 de Sorghum bicolor dans les chloroplastes de Nicotiana tabacum pour une synthèse guidée par la lumière. J. Exp. Bot. 67, 2495-2506 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Malhotra, K. et al. Ingénierie métabolique compartimentée pour la biosynthèse de l'artémisinine et le traitement efficace du paludisme par administration orale de cellules végétales. Mol. Usine 9, 1464–1477 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fuentes, P. et al. Une nouvelle approche de biologie synthétique permet le transfert de toute une voie métabolique d'une plante médicinale à une culture de biomasse. Elife 5, e13664 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Farhi, M. et al. Génération de l'artémisinine, un puissant antipaludéen, dans le tabac. Nat. Biotechnol. 29, 1072-1074 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang, B. et al. La production transitoire d'artémisinine chez Nicotiana benthamiana est stimulée par une protéine de transfert lipidique spécifique d'A. annua. Métab. Ing. 38, 159-169 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fräbel, S. et al. Ingénierie de précurseurs d'indigo halogénés nouveaux dans la nature dans les plantes. Métab. Ing. 46, 20-27 (2018).

Article PubMed CAS Google Scholar

Gallage, NJ et al. La localisation intracellulaire de la machinerie biosynthétique de la vanilline dans les gousses de vanille planifolia. Cellule végétale Physiol. 59, 304–318 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

De La Peña, R. & Sattely, ES Le réacheminement de la biosynthèse des terpènes végétaux permet l'élucidation de la voie de la momilactone. Nat. Chim. Biol. 17, 205-212 (2021).

Article CAS Google Scholar

Rin, S. et al. Profils d'expression des gènes des enzymes impliquées dans la production de capsidiol chez Nicotiana benthamiana. J. Gen. Plant Pathol. 86, 340–349 (2020).

Article CAS Google Scholar

Larsen, B. et al. Identification des transporteurs de glucosides iridoïdes chez Catharanthus roseus. Cellule végétale Physiol. 58, 1507-1518 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, K. et al. Localisation spécifique aux cellules des alcaloïdes dans le tissu souche de Catharanthus roseus mesurée avec Imaging MS et Single-cell MS. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 113, 3891–3896 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, K. et al. La complexité de la localisation intercellulaire des alcaloïdes révélée par la métabolomique unicellulaire. N. Phytol. 224, 848–859 (2019).

Article CAS Google Scholar

Payne, RME et al. Un transporteur NPF exporte un intermédiaire alcaloïde indole monoterpène central de la vacuole. Nat. Plantes 3, 16208 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Chanson, C.-P. et coll. Un probable échangeur Na+(K+)/H+ sur l'enveloppe du chloroplaste joue un rôle dans l'homéostasie du pH et le développement des chloroplastes chez Arabidopsis thaliana. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 101, 10211–10216 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Linka, N. & Weber, APM Transporteurs de métabolites intracellulaires dans les plantes. Mol. Usine 3, 21–53 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Farrow, SC et al. Biosynthèse d'un agent anti-addiction à partir de la plante iboga. Confiture. Chim. Soc. 141, 12979–12983 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trenti, F. et al. Étapes précoces et tardives de la biosynthèse de la quinine. Org. Lett. 23, 1793–1797 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sainsbury, F., Thuenemann, EC & Lomonossoff, GP pEAQ : vecteurs d'expression polyvalents pour une expression transitoire facile et rapide de protéines hétérologues dans les plantes. Biotechnologie Végétale. J. 7, 682–693 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Engler, C., Youles, M. & Grüetzner, R. Une boîte à outils de clonage modulaire Golden Gate pour les plantes. Synthé ACS. Biol. 3, 839–843 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cai, Y.-M., Carrasco Lopez, JA & Patron, NJ Phytobricks : assemblage manuel et automatisé de constructions pour les usines d'ingénierie. Méthodes Mol. Biol. 2205, 179–199 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Patron, NJNJ et al. Normes pour la biologie synthétique des plantes : une syntaxe commune pour l'échange de parties d'ADN. N. Phytol. 208, 13-19 (2015).

Article CAS Google Scholar

Rodríguez-López, CE et al. Deux enzymes bi-fonctionnelles du cytochrome P450 CYP72 de l'olive (Olea europaea) catalysent le clivage oxydatif de la liaison CC dans la biosynthèse des secoxy-iridoïdes - déterminants de la saveur et de la qualité de l'huile d'olive. N. Phytol. 229, 2288-2301 (2021).

Article CAS Google Scholar

Stavrinides, A. et al. L'étude structurelle de la synthèse des alcaloïdes de l'hétéroyohimbine révèle des éléments de site actifs qui contrôlent la stéréosélectivité. Nat. Commun. 7, 12116 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afgan, E. et al. La plateforme Galaxy pour des analyses biomédicales accessibles, reproductibles et collaboratives : mise à jour 2018. Nucleic Acids Res. 46, W537–W544 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Naim, F. et al. Ingénierie avancée du métabolisme des lipides chez Nicotiana benthamiana à l'aide d'un projet de génome et de la protéine V2 Viral Silencing-Suppressor. PLoS One 7, e52717 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yauk, Y.-K. et coll. Manipulation de la séquestration et de la libération de composés de saveur et d'arôme à l'aide d'une glycosyltransférase avec une spécificité pour les alcools terpéniques. Plant J. 80, 317–330 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ohgami, S. et al. Glycosylation volatile dans les théiers : Les glycosylations séquentielles pour la biosynthèse des β-primévérosides aromatiques sont catalysées par deux glycosyltransférases de Camellia sinensis. Physique Végétale. 168, 464–477 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Asada, K. et al. Une glucosyltransférase d'acide 7-désoxyloganétique contribue à une étape clé dans la biosynthèse de la sécologanine chez la pervenche de Madagascar. Cellule végétale 25, 4123–4134 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagatoshi, M., Terasaka, K., Nagatsu, A. & Mizukami, H. Glucosyltransférase spécifique aux iridoïdes de Gardenia jasminoides. J. Biol. Chem. 286, 32866–32874 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, PR, Møller, BL & Høj, PB L'UDP-glucose: P-hydroxymandelonitrile-O-glucosyltransférase qui catalyse la dernière étape de la synthèse de la dhurrine glucoside cyanogène dans le sorgho bicolore. J. Biol. Chim. 274, 35483–35491 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bonisch, F. et al. Une UDP-glucose : Monoterpénol glucosyltransférase ajoute à la diversité chimique du métabolome de la vigne. Physique Végétale. 165, 561-581 (2014).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Bonisch, F. et al. Le profilage basé sur l'activité d'une banque d'aglycones physiologiques révèle la promiscuité des accepteurs de sucre des UDP-glucosyltransférases de la famille 1 du raisin. Physique Végétale. 166, 23–39 (2014).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Stamatakis, A. RAxML version 8 : un outil pour l'analyse phylogénétique et la post-analyse des grandes phylogénies. Bioinformatique 30, 1312-1313 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5 : un outil en ligne pour l'affichage et l'annotation d'arbres phylogénétiques. Nucleic Acids Res. 49, W293–W296 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, B. et al. Imagerie dynamique de locus génomiques dans des cellules humaines vivantes par un système CRISPR/Cas optimisé. Cellule 155, 1479-1491 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horsch, RB et al. Une méthode simple et générale pour transférer des gènes dans des plantes. Sciences 227, 1229-1231 (1985).

Article CAS Google Scholar

Murashige, T. & Skoog, F. Un milieu révisé pour une croissance rapide et des dosages biologiques avec des cultures de tissus de tabac. Physiol. Usine. 15, 473–497 (1962).

Article CAS Google Scholar

Gamborg, OL, Miller, RA et Ojima, K. Besoins en éléments nutritifs des cultures en suspension de cellules racinaires de soja. Exp. Cell Res. 50, 151–158 (1968).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cai, Y.-M., Dudley, QM et Patron, NJ Mesure du nombre de copies du transgène dans les plantes à l'aide de la PCR numérique en gouttelettes. Bio Protocole. 11, e4075 (2021).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Baek, E., Yoon, J.-Y. & Palukaitis, P. Validation de gènes de référence pour quantifier les modifications de l'expression génique dans le tabac infecté par un virus. Virologie 510, 29–39 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions Benjamin Lichman pour ses conseils sur le travail avec MLPL. Nous remercions également Nicola Soranzo pour son aide dans l'analyse RNAseq au sein de Galaxy et Yaomin Cai pour son aide dans la gestion et la soumission des données. pL0-AstHMGR était un généreux don d'Anne Osbourn. Les plasmides pNJB069 (pTRV1), pEE393 et ​​pEE515 ainsi que les graines de N. benthamiana exprimant SpCas9 étaient un cadeau généreux de Dan Voytas. La préparation et le séquençage de la bibliothèque ont été fournis via la capacité nationale de BBSRC en génomique et en analyse de cellules individuelles (BBS/E/T/000PR9816) à l'Institut Earlham par des membres du groupe de pipelines de génomique. Nous remercions également Lesley Phillips, Catherine Taylor et les services horticoles JIC pour leur aide dans la culture des plantes. Les auteurs remercient le soutien du Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC) de UK Research and Innovation. Cette recherche a été financée par le BBSRC Core Strategic Program Grant BB/CSP1720/1 et son lot de travaux constitutif BBS/E/T/000PR9819 Regulatory interactions and Complex Phenotypes et par un prix de partenariat industriel avec Leaf Expression Systems (BB/P010490/1) . Le SOC reconnaît également le soutien de la Max Planck Society et du Conseil européen de la recherche (ERC 788301). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Nathaniel H.Sherden

Adresse actuelle : Octagon Therapeutics Ltd, 700 Main Street, North Cambridge, MA, 02139, États-Unis

Biologie de l'ingénierie, Earlham Institute, Norwich Research Park, Norwich, Norfolk, NR4 7UZ, Royaume-Uni

Quentin M. Dudley, Seohyun Jo et Nicola J. Patron

Département de biosynthèse des produits naturels, Institut Max Planck d'écologie chimique, Iéna, 07745, Allemagne

Delia Ayled Serna Guerrero, Sarah E. O'Connor et Lorenzo Caputi

Centre John Innes, Parc de recherche de Norwich, Norwich, NR4 7TJ, Royaume-Uni

Monika Chhetry, Mark A. Smedley, Wendy A. Harwood et Nathaniel H. Sherden

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

QMD, SEO, LC et NJP ont conçu l'étude. QMD a réalisé l'assemblage de l'ADN et l'expression transitoire avec l'aide du SJNHS, construit et réalisé des expériences d'infiltration avec des vecteurs pEAQ. QMD a effectué une analyse transcriptomique, assemblé tous les vecteurs pour la mutagenèse, délivré des virus à ARN pour la mutagenèse et effectué le génotypage. MC et MAS ont effectué toutes les cultures de tissus végétaux sous la supervision de WAHDASG et LC ont effectué l'extraction et l'analyse des métabolites. QMD, SEO, LC et NJP ont rédigé le manuscrit. SEO et NJP ont obtenu un financement et assuré la supervision.

Correspondance à Lorenzo Caputi ou Nicola J. Patron.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Rédacteurs en chef de la gestion principale : Zhijuan Qiu.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Dudley, QM, Jo, S., Guerrero, DAS et al. Reconstitution de la biosynthèse des alcaloïdes indoles monoterpènes dans le génome modifié Nicotiana benthamiana. Commun Biol 5, 949 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

Télécharger la citation

Reçu : 04 juillet 2022

Accepté : 25 août 2022

Publié: 10 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.