Perturbation et récupération du microbiome nasal après traitement à la mupirocine chez les porteurs et non porteurs de Staphylococcus aureus

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19738 (2022) Citer cet article

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Les procédures de décolonisation nasale contre le pathogène opportuniste Staphylococcus aureus reposent sur l'utilisation de médicaments antimicrobiens topiques, dont l'impact sur le microbiote nasal est mal connu. Nous avons examiné cet impact chez les porteurs et les non-porteurs sains de S. aureus. Il s'agit d'une étude de cohorte interventionnelle prospective de 8 porteurs de S. aureus et de 8 non-porteurs traités avec des bains nasaux de mupirocine et de chlorhexidine. Des prélèvements nasaux séquentiels ont été effectués sur 6 mois. S. aureus a été détecté par culture quantitative et génotypé à l'aide du typage spa. Le métabarcodage au niveau de l'espèce 16S basé sur l'ARN a été utilisé pour évaluer la diversité microbienne vivante. Les espèces Dolosigranulum pigrum, Moraxella nonliquefaciens et Corynebacterium propinquum étaient corrélées négativement avec le portage de S. aureus. Le traitement à la mupirocine a éliminé efficacement S. aureus, D. pigrum et M. nonliquefaciens, mais pas les corynébactéries. La recolonisation par S. aureus chez les porteurs s'est produite plus rapidement que la recolonisation par l'espèce dominante chez les non-porteurs (médiane de 3 contre 6 mois, respectivement). La plupart des isolats de S. aureus en recolonisation avaient le même type de spa que l'isolat initial. L'impact du traitement mupirocine-chlorhexidine sur le microbiote nasal était toujours détectable après 6 mois. La recolonisation de S. aureus a précédé la récupération du microbiote, soulignant la forte adaptation de ce pathogène à la niche nasale et l'efficacité transitoire de la procédure de décolonisation.

Staphylococcus aureus est un agent pathogène opportuniste et une cause fréquente d'infections graves. Environ 20 % de la population générale sont des porteurs persistants de S. aureus et 30 % supplémentaires sont des porteurs intermittents1. S. aureus est généralement transporté dans le nez et moins fréquemment dans la gorge, la peau et le périnée1.

Les porteurs de Staphylococcus aureus sont plus à risque d'infection après des procédures invasives et une chirurgie2,3. Pour prévenir les infections, plusieurs pays recommandent d'éliminer S. aureus du nez avant l'intervention à risque en utilisant une procédure de décolonisation4. Cela implique généralement un traitement antimicrobien topique avec une pommade nasale à la mupirocine avec ou sans lavage cutané du corps et des cheveux à la chlorhexidine. Différentes approches de décolonisation ont émergé en raison des coûts et des problèmes d'organisation des soins de santé5. Alors que certains conseillent de traiter tous les patients subissant des interventions à risque, d'autres limitent la décolonisation aux seuls porteurs confirmés.

Bien que nous sachions que la composition du microbiome nasal est liée à la présence de S. aureus6,7, l'impact des procédures de décolonisation sur le microbiote nasal n'est pas encore entièrement compris. Dans des études antérieures sur le microbiome nasal, le portage de S. aureus était associé à des abondances relatives plus élevées de Cutibacterium acnes, Corynebacterium accolens et de staphylocoques non aureus, et à des abondances plus faibles de Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Dolosigranulum spp. et Cutibacterium granulosum6,7. Ces associations suggèrent que la distribution des espèces microbiennes dans le nez influence la persistance de S. aureus, peut-être par la compétition pour les nutriments et les sites de liaison épithéliaux8. À son tour, l'altération de la distribution microbienne après une procédure de décolonisation pourrait avoir un impact sur la probabilité d'une recolonisation persistante de S. aureus et, d'un point de vue clinique, d'un échec de la décolonisation. Cependant, l'ampleur et la durée des altérations du microbiote après la décolonisation ne sont pas élucidées. Jusqu'à présent, une étude sur le microbiome d'un seul patient a révélé des changements dans la composition et la biodiversité du microbiote nasal après un traitement à la mupirocine9, contrairement à une précédente étude culturomique de 5 volontaires sains dans laquelle aucun changement significatif de la richesse et de la diversité du microbiote n'a été trouvé jusqu'à 1 mois après la décolonisation10.

Pour déchiffrer les relations entre le portage nasal de S. aureus, le microbiote nasal et les procédures de décolonisation, nous avons mené une étude prospective interventionnelle de cohorte de porteurs et non porteurs de S. aureus, en surveillant les changements de la communauté microbienne sur 6 mois après le traitement à la mupirocine-chlorhexidine. À l'aide de cultures quantitatives et de métabarcoding 16S, nous avons examiné l'impact de la décolonisation sur les communautés bactériennes et le délai de recolonisation avec S. aureus et d'autres espèces dominantes.

Sur 35 volontaires, 8 porteurs et 8 non porteurs ont été inclus (voir organigramme de sélection des patients sur la Fig. 1). Le groupe porteur de S. aureus était composé de 3 hommes et 5 femmes âgés de 22 à 71 ans (médiane, 26 ans). Les non-porteurs étaient 2 hommes et 6 femmes âgés de 18 à 62 ans (médiane, 56 ans). Aucun participant n'a signalé l'utilisation d'antiviraux, d'antiparasitaires, d'immunosuppresseurs ou de probiotiques au cours des 3 mois précédant ou pendant l'étude. Un non-porteur a rapporté l'utilisation d'amoxicilline/acide clavulanique, 5 jours avant le prélèvement J0 et à nouveau entre les prélèvements M3 et M6. Ce participant a été retenu car l'utilisation d'antimicrobiens a eu lieu après le recrutement et la composition du microbiote ne différait pas des autres non-porteurs avant la décolonisation. Aucun participant n'a signalé de port antérieur de SARM. Les 16 participants avaient au moins 1 facteur de risque d'acquisition de S. aureus (tableau supplémentaire 1).

Organigramme du recrutement des participants. Au total, 35 volontaires ont été recrutés et sélectionnés pour leur éligibilité. Seize participants ont terminé l'étude, dont 8 porteurs et 8 non porteurs.

La dynamique de l'élimination et de la recolonisation de S. aureus après le traitement de décolonisation a été examinée à l'aide d'une culture quantitative (Fig. 2A) et d'un métabarcodage d'ARN (Fig. 2B). Les deux méthodes ont montré une forte diminution des charges de S. aureus immédiatement après la décolonisation, suivie d'une augmentation progressive indiquant une recolonisation pour certains porteurs. L'échec de la décolonisation chez un porteur a été confirmé dans le premier échantillon post-décolonisation par les deux méthodes (Fig. 2). La recolonisation a été définie comme une culture positive pour S. aureus (> 8 UFC/mL) post-décolonisation. Cinq porteurs (C1, C2, C5, C6 et C7) ont été recolonisés au cours de la période de suivi, dont 3 porteurs dans le mois suivant la décolonisation. Dans le groupe non porteur, 4 cultures positives pour S. aureus ont été trouvées après la décolonisation, dont 3 avec seulement 1 UFC/mL.

Dynamique de l'abondance de S. aureus dans des échantillons nasaux de porteurs et de non-porteurs en cours de décolonisation. Sont indiqués l'abondance de S. aureus en culture quantitative (CFU/ml sur une échelle logarithmique ; A) et la proportion dans le métabarcodage d'ARN 16S (B) dans le temps chez 8 porteurs (rouge) et 8 non porteurs (bleu). D0 et D7 désignent des échantillons prélevés immédiatement avant et après la procédure de décolonisation, respectivement. Les lignes pointillées indiquent les données de chaque participant. Les lignes pleines et la bande colorée indiquent la moyenne et l'intervalle de confiance à 95 %. L'analyse de la culture et du métabarcodage a identifié une forte diminution de l'abondance de S. aureus après la décolonisation suivie d'une recolonisation. En moyenne, l'abondance post-décolonisation de S. aureus était inférieure à celle d'avant la décolonisation.

Le métabarcodage de l'ARN a montré des résultats de recolonisation différents. Alors que 5 porteurs (C1, C2, C3, C5 et C8) ont également été recolonisés selon le métabarcodage de l'ARN, des écarts ont été trouvés pour 4 porteurs (C3, C6, C7 et C8). Pour 2 porteurs (C5 et C8), le métabarcoding ARN a montré une recolonisation sans culture positive. 2 autres porteurs (C6 et C7) n'ont montré aucune recolonisation dans le métabarcoding de l'ARN malgré une culture positive.

Les types de spa ont été déterminés chez les porteurs présentant une recolonisation par S. aureus en culture (n = 5). Tous les porteurs de S. aureus recolonisés sauf un présentaient le même type de spa dans les échantillons pré- et post-décolonisation. Chez 2 porteurs, un type de spa différent a été trouvé, suggérant une colonisation transitoire par une souche différente de la souche porteuse pré-décolonisation. Les résultats du typage Spa sont présentés dans le tableau 1. Les détails du délai de recolonisation et des charges UFC/mL sont présentés dans la Fig. 1 supplémentaire. Aucune résistance phénotypique à la méthicilline n'a été trouvée dans les isolats testés.

Dans l'ensemble, la décolonisation de S. aureus est restée réussie sur une période de 6 mois chez seulement 3 participants (38%) (Fig. 2 et Fig. 1 supplémentaire), conformément aux résultats précédents11. Fait intéressant, l'approche de métabarcodage a détecté de petites proportions (~ 1 à 5%) de lectures de S. aureus 2 jours et 1 mois après la décolonisation chez plusieurs non-porteurs (Fig. 2B). Cela pourrait refléter une invasion transitoire de la niche nasale par des isolats de S. aureus, éventuellement facilitée par la perturbation du microbiome nasal induite par la décolonisation, comme décrit dans le microbiote intestinal après des perturbations induites par des antibiotiques12. Ce portage intermittent est à prévoir dans la population normale.

Avant la décolonisation, neuf espèces bactériennes dominantes dans le microbiote nasal, dont S. aureus, S. epidermidis, D. pigrum, Moraxella nonliquefaciens, C. acnes et 4 espèces de Corynebactaria ont été identifiées (Fig. 3A, C ; voir les détails pour chaque participant dans Supplément figure 2). D. pigrum, un taxon commun trouvé dans les narines antérieures, était particulièrement abondant et répandu chez les non-porteurs. C. propinquum était présent dans les deux groupes et était en moyenne 15 % plus abondant chez les non-porteurs. Les espèces sensibles à la mupirocine, notamment S. aureus et S. epidermidis, D. pigrum et M. nonliquefaciens, ont été pratiquement éliminées du microbiote après la décolonisation, tandis que les corynébactéries résistantes à la mupirocine et C. acnes sont restées substantiellement abondantes13,14. Après décolonisation, la proportion moyenne de C. pseudodiphteriticum chez les non-porteurs, mais pas les porteurs, a décuplé après 7 jours et la proportion de S. epidermidis a décuplé après 1 mois. À d'autres moments, les proportions moyennes de C. pseudodiphteriticum et de S. epidermidis étaient comparables chez les porteurs et les non-porteurs. Parmi les 2 porteurs et les 4 non porteurs colonisés par plus de 10 % de D. pigrum (Fig. 2 supplémentaire), 1 a été recolonisé par D. pigrum après 1 mois, 2 après 3 mois et tous après 6 mois. M. nonliquefaciens, qui a été observé chez 2 non-porteurs, n'a recolonisé qu'un seul participant après 6 mois. Le temps médian de recolonisation avec D.pigrum et M.nonliquefaciens, 2 taxons majeurs présents chez les non-porteurs, était de 6 mois. En revanche, le temps médian de recolonisation de S. aureus chez les porteurs était de 3 mois. Les profils de microbiote des participants individuels sont présentés dans la Fig. 2 supplémentaire.

Evolution de la structure communautaire du microbiote nasal avant et après décolonisation de la mupirocine chez les porteurs et non porteurs de S. aureus. Les diagrammes à barres de diversité des proportions moyennes d'espèces (A, C) et la dissimilarité de ces proportions (B, D) chez chaque patient (lignes pointillées) et en moyenne (lignes pleines ; la zone ombrée est la bande de confiance à 95 % de la moyenne ). Une valeur élevée pour la dissimilarité Bray-Curtis indique une grande différence dans la structure de la communauté par rapport à l'état initial du microbiote avant la décolonisation. Des prélèvements nasaux ont été effectués immédiatement avant la décolonisation (J0) et après 7 jours (J7) et 1 (M1), 3 (M3) et 6 (M6) mois chez 8 porteurs de S. aureus (A,B) et non porteurs (C, D). Les noms complets des bactéries sont, dans l'ordre : Staphylococcus aureus, Dolosigranulum pigrum, Moraxella nonliquefaciens, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium macginleyi, Staphylococcus epidermidis, Cutibacterium acnes.

Pour fournir une évaluation plus synthétique des changements induits par la décolonisation de la structure de la communauté microbienne, nous avons calculé la dissemblance Bray-Curtis de l'assemblage d'espèces à chaque instant, par rapport à l'instant D0 initial chez le même patient (Fig. 3B, D ). La dissimilarité moyenne de Bray-Curtis était maximale immédiatement après la décolonisation chez les porteurs et les non-porteurs, indiquant l'état le plus perturbé du microbiote. De manière frappante, la dissemblance a fortement diminué chez les porteurs mais est restée principalement stable chez les non-porteurs, indiquant que le microbiote des porteurs est revenu (partiellement) vers son état initial plus rapidement que chez les non-porteurs, en ligne avec une recolonisation plus rapide par S. aureus par rapport aux espèces dominantes trouvées dans non porteurs. Après 6 mois, les dissemblances moyennes par rapport à l'état initial sont restées importantes (~ 0, 5–0, 7) à la fois chez les porteurs et les non-porteurs (Fig. 3B, D). Il est important de noter que l'évolution de la structure de la population variait fortement d'un participant à l'autre (voir les lignes pointillées sur les Fig. 3B, D), avec des schémas de récupération du microbiote allant d'une récupération rapide (dissimilarité < 0,2 après 1 mois) à pratiquement aucune récupération (dissimilarité > 0,9 après 6 mois). ) à la fois chez les porteurs et les non-porteurs.

Dans cette étude longitudinale des porteurs et des non-porteurs de S. aureus subissant une décolonisation nasale de la mupirocine, nous constatons que la recolonisation de S. aureus chez les porteurs s'est produite plus rapidement que la recolonisation par l'espèce dominante chez les non-porteurs. Ces résultats mettent en évidence l'efficacité transitoire de la procédure de décolonisation de S. aureus et la forte adaptation de S. aureus à la niche nasale.

À côté d'un cas d'échec de la décolonisation, nous avons observé une recolonisation fréquente avec S. aureus au cours de la période de suivi de 6 mois. Le délai de recolonisation variait de 1 à 3 mois, conformément aux observations précédentes dans lesquelles le délai de recolonisation variait de 2 semaines à 6 mois après le traitement à la mupirocine15. Dans une autre étude longitudinale collectant des échantillons de 571 participants tous les 2 mois pendant > 2 ans, les antibiotiques anti-staphylococciques ont augmenté le taux d'acquisition de S. aureus dans les 4 mois suivant le traitement16, suggérant que la perturbation du microbiote par les antibiotiques facilite l'invasion par S. aureus. Dans notre étude, 4 des 5 cas de recolonisation se sont finalement produits avec le même type de spa que celui isolé initialement du porteur. Cependant, une colonisation transitoire avec un autre type de spa a également été démontrée. Ceci est conforme à d'autres études montrant un portage longitudinal de la même souche, avec un portage intermittent d'autres souches également16,17,18. Bien que des études longitudinales suggèrent que la perte et l'acquisition de S. aureus se produisent comme des événements naturels16,18, une autre raison de la recolonisation pourrait être l'absence de décolonisation réussie. La résistance au traitement de décolonisation pourrait faciliter la recolonisation. Cependant, comme la surveillance nationale néerlandaise de la résistance à S. aureus a montré de faibles niveaux de résistance à la mupirocine (1%)19, il semble peu probable que cela entraîne une recolonisation chez les participants à notre étude. La recolonisation à partir d'un site corporel extra-nasal non traité, tel que le pharynx, ou par des membres du ménage est une explication plus probable.

Outre la perte de S. aureus, la décolonisation a entraîné l'élimination immédiate de S. epidermidis, D. pigrum et M. nonliquefaciens du nez. Chez les non-porteurs, une tendance à une abondance plus élevée de C. propinquum a été observée, tandis qu'une augmentation de C. accolens et de S. epidermidis a été montrée chez les porteurs effectivement décolonisés. En effet, le traitement à la mupirocine a été précédemment lié à une augmentation de l'abondance relative des corynébactéries (non classées) et de C. acnes, ainsi qu'à une diminution de l'abondance de S. epidermidis20. Ensemble, ces résultats impliquent un réarrangement du microbiote nasal après le traitement de décolonisation et l'élimination des espèces sensibles à la mupirocine, y compris S. aureus, permettant à de nouveaux taxons d'envahir la niche nasale.

Notre étude a des limites au-delà de sa petite taille d'échantillon. Pour améliorer la participation à l'étude, nous avons adopté une stratégie d'auto-échantillonnage qui a permis aux participants d'envoyer des échantillons par le service postal régulier. Cette méthode a été jugée appropriée pour la détection de S. aureus précédemment21,22. Néanmoins, le transport retardé a entraîné le traitement de 20 % des échantillons > 48 h après le prélèvement. Étant donné que seuls 3 des 27 échantillons retardés chez les porteurs étaient négatifs à la culture, le risque de cultures de S. aureus faussement négatives en raison du transport peut être considéré comme faible. Cependant, l'impact du retard sur les approches de métabarcodage est inconnu. Néanmoins, le transport retardé n'a eu aucun effet sur les résultats globaux de recolonisation dans cette étude.

Des divergences ont été trouvées entre les résultats de culture quantitative et le métabarcodage d'ARN concernant la présence de S. aureus dans les échantillons post-décolonisation. Nous avons défini la recolonisation sur la base d'une culture positive pour S. aureus (> 8 UFC/mL) après décolonisation, conformément à notre définition du portage de S. aureus. La charge bactérienne nasale variable, la composition intrinsèque du microbiote ainsi que l'influence potentielle du transport vers l'installation de séquençage ajoutée aux analyses de métabarcodage d'ARN en plusieurs étapes font partie des nombreux facteurs expliquant ces différences avec les résultats de culture. Les deux méthodes s'accordaient sur le statut de recolonisation dans trois transporteurs seulement.

Dans l'ensemble, nos résultats mettent en évidence la sensibilité de la communauté bactérienne nasale au traitement par la mupirocine et soulignent le fait que la cible de décolonisation, à savoir S. aureus, réintègre la niche nasale comparativement plus rapidement que les espèces dominantes chez les non-porteurs. Cela soutient l'utilisation actuelle de la mupirocine comme procédure de prévention à court terme précédant une intervention à risque identifiée, plutôt que comme moyen d'éliminer les isolats de S. aureus en circulation.

Il s'agit d'une étude de cohorte interventionnelle prospective sur des porteurs et des non-porteurs sains de S. aureus aux Pays-Bas. Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la loi néerlandaise sur la recherche médicale impliquant des sujets humains (WMO). Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique médicale local du centre médical universitaire Erasmus de Rotterdam, aux Pays-Bas (MEC-2018-091). Un consentement éclairé écrit a été obtenu pour tous les participants. Les participants ont été recrutés via des annonces dans les universités néerlandaises et les réseaux sociaux des équipes de recherche. Les critères d'exclusion étaient l'âge < 18 ans, l'utilisation d'antibiotiques, d'antiparasitaires, d'antifongiques ou de probiotiques 3 mois avant le recrutement, l'allergie connue aux composants du traitement d'intervention, les femmes enceintes et allaitantes, les maladies chroniques connues affectant le système immunitaire, les dermatoses chroniques sévères, statut immunodéprimé ou utilisation de médicaments immunosuppresseurs.

Après avoir rempli un questionnaire d'éligibilité, tous les volontaires ont été dépistés pour le portage de S. aureus comme décrit précédemment23. Le portage de S. aureus a été déterminé par culture quantitative de 2 écouvillons nasaux hebdomadaires. Les porteurs persistants de S. aureus ont été définis comme 2 cultures positives avec > 8 UFC/mL pour chaque culture. Les non-porteurs ont été définis comme 2 cultures négatives pour S. aureus. Les porteurs intermittents de S. aureus ont été exclus de toute participation ultérieure à l'étude. Les volontaires éligibles étaient inscrits selon le principe du premier arrivé, premier servi.

Les participants éligibles ont été invités à remplir un questionnaire concernant les facteurs de risque d'acquisition de S. aureus. Tous les participants ont reçu un traitement de décolonisation. La décolonisation consistait en une pommade nasale à la mupirocine (2 %, GlaxoSmithKline BV, Zeist, Pays-Bas) deux fois par jour et une solution cutanée de gluconate de chlorhexidine (4 % p/v, Regent Medical Overseas Limited, Oldham, Royaume-Uni) une fois par jour, les deux pendant 5 jours.

Des prélèvements nasaux ont été effectués 1 jour avant la décolonisation (J0) et 2 jours (J7), 1 mois (M1), 3 mois (M3) et 6 mois (M6) après la décolonisation. Tous les participants ont reçu une démonstration personnelle d'échantillonnage nasal par le chercheur exécutif. Par la suite, tous les échantillons ont été prélevés par les participants en insérant un écouvillon (ESwab, 490CE.A, Copan Italia, Brescia, Italie) dans une narine et en tournant 5 fois, en répétant cela dans la deuxième narine en utilisant le même écouvillon. Les écouvillons ont été collectés dans un récipient rempli de 1 ml de Liquid Amies modifié, une solution de collecte et de transport, et envoyés par courrier ordinaire (sans température contrôlée) ou déposés personnellement au laboratoire.

Des cultures quantitatives de S. aureus ont été menées pour examiner la dynamique du portage de S. aureus au cours de la période de suivi de 6 mois après la décolonisation. Les conteneurs d'écouvillons ont été vortexés pendant 20 s avant le placage. Des dilutions en série du milieu d'Amies ont été étalées sur de la gélose phénol mannitol-sel (PHMA) et incubées pendant 2 jours à 37 °C. Les écouvillons ont été placés dans un bouillon de sel de phénol mannitol (PHMB) et incubés pendant 7 jours à 37 ° C pour l'enrichissement. La croissance de S. aureus a été confirmée par un test d'agglutination au latex (Staph Plus Latex Kit, Diamondial, Vienne, Autriche). Des colonies de S. aureus morphologiquement différentes ont été sélectionnées pour le typage spa et le dépistage de la résistance à la méthicilline à l'aide de la gélose BBL CHROMagar MRSA II (BD, Breda, Pays-Bas).

Le typage moléculaire des isolats de S. aureus a été effectué pour déduire si la recolonisation avec S. aureus chez les porteurs décolonisés impliquait le même type spa. Le typage était limité au dernier moment de culture positive pour S. aureus et au dernier moment de culture positive pour S. aureus après la décolonisation chez les porteurs recolonisés. Les lysats d'ADN de S. aureus ont été préparés par ébullition dans Tris-HCl 10 mM, EDTA disodique 1 mM, pH 8,0 ou par extraction avec le kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Venlo, Pays-Bas) conformément aux instructions du fabricant. L'amplification de la région de répétition de la protéine A (spa) de S. aureus a été réalisée par PCR avec 2 jeux d'amorces. Un ensemble consistait en une amorce sens spa-1113, 5′-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3′ et une amorce antisens spa-1514, 5′-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3′24. L'autre ensemble était composé d'amorces sens spa-F1, 5′-AACAACGTAACGGCTTCATCC-3′ et spa-F2 5′-AGACGATCCTTCAGTGAGGC-3′ et d'amorces antisens spa-R1 5′-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3′. Les amplicons ont été purifiés avec ExoSAP-IT (Applied Biosystems) selon les instructions du fabricant et envoyés pour analyse de séquence (Baseclear, Leiden, Pays-Bas). Les séquences résultantes ont été analysées à l'aide de BioNumerics v7.6 (Applied Maths NV, Sint-Martens-Latem, Belgique) et les types de spa ont été attribués à l'aide de la base de données RidomStaphType (Ridom GmbH, Würzburg, Allemagne).

L'impact de la décolonisation sur le microbiome nasal et la récupération de la structure du microbiome après la décolonisation ont été examinés au moyen du métabarcodage de l'ARNr 16S. Le milieu Amies de chaque conteneur d'écouvillon nasal a été stocké à - 80 ° C le jour de la réception au laboratoire d'étude à Rotterdam, NL, puis envoyé à - 80 ° C au laboratoire d'analyse du microbiome à Lyon, FR. Pour capturer correctement l'impact de la décolonisation sur le microbiote vivant, le métabarcodage a utilisé l'ARN ribosomal 16S à base d'ARN (ARNr, qui est conservé dans les cellules vivantes mais rapidement éliminé après la mort cellulaire ou la lyse) plutôt que la séquence codante d'ADN, car l'ADN peut persister pendant des périodes prolongées après la mort cellulaire25,26,27,28. L'ARN a été extrait à l'aide du protocole tissulaire du kit Mag Bind® Total RNA 96 (Omega Bio-tek) à partir de 150 µL de matériel d'échantillons. La lyse cellulaire a été réalisée à l'aide de billes (Disruptor plate C plus - Omega Bio-tek) et de protéinase K pendant 15 min à 2600 rpm, suivi de 10 min à température ambiante sans agitation, et terminée par une digestion DNase I de 20 min à température ambiante . L'ARN a été quantifié à l'aide du kit QuantiFluor RNA sur Tecan Safire (TECAN). 10 ng d'ARN total ont été utilisés pour la transcription inverse à l'aide du kit de synthèse d'ADNc FIREScript RT (Solis Biodyne) avec des amorces aléatoires, puis l'ADNc a été purifié avec le réactif SPRIselect (coutre Beckman) et quantifié.

La région V1–V3 de l'ARNr a été amplifiée par PCR à l'aide du 5× HOT BIOAmp® BlendMaster Mix 12,5 mM MgCl 2 (Biofidal), 10× GC rich Enhancer (Biofidal) et BSA 20 mg/mL. La réaction PCR consistait en 30 cycles à 56 ° C en utilisant l'amorce directe 27F, 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' et l'amorce inverse 534R, 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGACAGATTACCGCGGCTTGCTGG-3' dans 25 µL de solution. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide de billes SPRIselect (Beckman Coulter) dans 20 µL d'eau sans nucléase et quantifiés à l'aide de QuantiFluor dsDNA (Promega). Les échantillons ont été indexés avec les codes-barres de lllumina avec les mêmes réactifs PCR au cours d'une PCR de 12 cycles, puis purifiés et quantifiés comme mentionné précédemment. Les échantillons ont été normalisés et regroupés, puis séquencés à l'aide de la Flow Cell Illumina MiSeq V3 en suivant les recommandations du constructeur pour une application appariée de 2 × 300 pb. Une moyenne de 130 000 relectures par échantillon a été obtenue.

Des tampons d'expérience ont été utilisés comme témoins négatifs pour détecter la contamination par l'ARN bactérien hors échantillon. L'extraction de l'ARN a été contrôlée à l'aide d'un mélange interne de Staphylococcus aureus ATCC29213 vivant et d'Escherichia coli ATCC25922 en proportions égales, permettant d'évaluer le biais d'extraction chez les bactéries Gram-positives et négatives. Le biais d'amplification par PCR a été contrôlé à l'aide d'un mélange d'ADN commercial de 8 espèces bactériennes (ZymoBIOMICS™ Microbial Community DNA Standard).

Les lectures de séquençage ont été vérifiées et coupées. Les paires de lecture appariées ont été fusionnées à l'aide de la version 38.49 de BBMap (disponible sur https://sourceforge.net/projects/bbmap/), avec des options par défaut en plus d'une taille unique minimale de 150 bp avec un score de qualité Phred moyen supérieur à 10, et une taille totale de paire d'au moins 400 pb. Les adaptateurs PCR ont été supprimés avec cutadapt v.2.1 (Martin 2011) puis dérépliqués à l'aide de vsearch v.2.12.029 avec l'option sizeout. Pour l'attribution des espèces, les lectures ont été alignées sur les séquences de la base de données NCBI blast 16S_ribosomal_RNA (date de version 03.12.2020) à l'aide de Blastn v.2.11.0+30,31, en conservant un maximum de 20 cibles de référence. Le nombre de lectures par espèce bactérienne a été normalisé pour tenir compte des variations spécifiques au taxon du nombre de copies des gènes d'ARNr 16S à l'aide de la base de données NCBI rrnDB-5.5 basée sur le nombre moyen de copies de gènes dans le taxon.

Pour optimiser la résolution du séquençage de l'attribution taxonomique de lecture, nous avons utilisé un logiciel bioinformatique interne accessible au public à l'adresse https://github.com/rasigadelab/taxonresolve. En bref, lorsqu'une lecture correspond à des séquences de plusieurs espèces avec des scores d'alignement identiques, les pipelines d'attribution taxonomique produisent généralement le niveau taxonomique supérieur tel que le genre (par exemple, Staphylococcus spp. lorsqu'une lecture correspond à S. aureus et S. epidermidis). Cette perte d'information peut être problématique lorsque la discrimination au niveau des espèces est importante. Pour éviter de perdre des informations au niveau des espèces, le logiciel taxonresolve attribue les lectures avec des espèces incertaines à des groupes d'espèces plutôt qu'à des genres.

Les espèces bactériennes jugées présentes à partir de sources contaminantes telles que les réactifs des kits et trouvées dans les contrôles négatifs, principalement du genre Bacillus, ont été supprimées. Au total, 1376 espèces ou groupe d'espèces ont été retenues. Les courbes de raréfaction correspondant à l'effort de séquençage pour évaluer la richesse en espèces dans les échantillons sont présentées dans la Fig. 3 supplémentaire. La plupart des échantillons ont atteint un plateau après 40 000 séquences.

Étant donné la petite taille de l'échantillon par rapport au nombre de variables et d'espèces considérées dans cette étude, aucun test d'hypothèse n'a été effectué et nous fournissons une évaluation descriptive des résultats. Dans les figures, les intervalles de confiance à 95 % des moyennes ont été calculés sur la base de l'approximation normale, après transformation logarithmique pour les UFC/mL et transformation logarithmique des cotes pour les quantités restreintes à l'intervalle [0, 1], telles que les proportions.

Dans les analyses de diversité microbienne, nous avons retenu les 9 espèces bactériennes les plus répandues et regroupé les autres espèces dans une catégorie « Autres ». Pour évaluer la perturbation et la récupération éventuelle du microbiote, la divergence du microbiote échantillonné par rapport au microbiote initial avant le traitement (D0) a été évaluée à l'aide de la dissemblance de Bray-Curtis à chaque instant d'échantillonnage par rapport au premier échantillon du même patient. .

Le code logiciel des analyses est disponible sur https://github.com/rasigadelab/macotra-metabarcoding. Les données sont disponibles sur https://zenodo.org/record/6382657. Les analyses et les chiffres ont utilisé le logiciel R v3.6.032 avec les packages dplyr33, ggplot234, vegan35 et MicrobiomAnalyst disponibles sur https://www.microbiomeanalyst.ca36,37.

Les ensembles de données générés pour cette étude sont librement disponibles dans Zenodo à https://doi.org/10.5281/zenodo.6382657.

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Nous remercions tous les participants pour leur contribution à cette étude. Remerciements particuliers à Willem van Wamel, Patricia Vellekoop et Willemien Zandijk pour l'assistance en laboratoire, ainsi qu'à Agnès Nguyen (Biofal, Vaulx-en-Velin, France), pour des discussions et une assistance approfondies concernant la stratégie de métabarcodage utilisée dans cet article. Ce travail faisait partie du projet MACOTRA, financé par ZonMw Grant numéro 547001006 et ANR Grant numéro 16-JPEC-0006. Nous reconnaissons tous les membres du groupe d'étude MACOTRA comme indiqué dans les informations supplémentaires.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Valérie O. Baede, Anaïs Barray, Margreet C. Vos et Jean-Philippe Rasigade.

Département de microbiologie médicale et des maladies infectieuses, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, Pays-Bas

Valérie O. Baede, Mehri Tavakol & Margreet C. Vos

CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Université de Lyon, Inserm U1111, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université Lyon 1, CNRS, UMR5308, Lyon, France

Anaïs Barray, Gérard Lina & Jean-Philippe Rasigade

Centre National de Référence des Staphylocoques, Institut des Agents Infectieux, Hôpital de la Croix Rousse, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

Anaïs Barray, Gérard Lina & Jean-Philippe Rasigade

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AB et VB ont rédigé le manuscrit original. MV et JPR ont révisé et édité le manuscrit. MV, GL, JPR ont conceptualisé et supervisé le projet. VB et MT ont procédé au recrutement de la cohorte. AB, VB et MT ont conçu des méthodologies in vitro et généré des données et des chiffres. AB a développé des programmes d'analyse bioinformatique et biostatistique pour l'étude. AB, VB, MT et JPR ont effectué une analyse statistique. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Jean-Philippe Rasigade.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Baede, VO, Barray, A., Tavakol, M. et al. Perturbation et récupération du microbiome nasal après traitement à la mupirocine chez les porteurs et non porteurs de Staphylococcus aureus. Sci Rep 12, 19738 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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Reçu : 07 mai 2022

Accepté : 27 septembre 2022

Publié: 17 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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