Évaluation des génotypes, des endosymbiontes et des caractéristiques cliniques d'Acanthamoeba guéri d'une infection oculaire

BMC Infectious Diseases volume 22, Numéro d'article : 757 (2022) Citer cet article

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Acanthamoeba est un agent pathogène émergent, tristement célèbre pour sa résistance aux composés antiprotozoaires, aux désinfectants et aux environnements difficiles. Il est connu pour provoquer une kératite, une infection cornéenne menaçant la vue, douloureuse et difficile à traiter, souvent signalée chez les porteurs de lentilles de contact et les patients souffrant de traumatismes oculaires. Acanthamoeba comprend plus de 24 espèces et actuellement 23 génotypes (T1-T23) ont été identifiés.

Cette étude rétrospective a été conçue pour examiner les espèces et les génotypes d'Acanthamoeba récupérés chez des patients atteints de kératite à Acanthamoeba (AK), déterminer la présence d'endosymbiontes dans des isolats oculaires d'Acanthamoeba et examiner les présentations cliniques.

Treize patients AK confirmés par culture traités dans un établissement de soins oculaires tertiaires à Hyderabad, en Inde, de février à octobre 2020 ont été inclus dans cette étude. Les manifestations cliniques, les médicaments et les résultats visuels de tous les patients ont été obtenus à partir des dossiers médicaux. Les isolats d'Acanthamoeba ont été identifiés par séquençage du gène de la sous-unité nucléaire ribosomale (rns). Les isolats d'Acanthamoeba ont été évalués pour la présence d'endosymbiontes bactériens ou fongiques à l'aide d'essais moléculaires, de PCR et d'hybridation in situ par fluorescence (FISH).

L'âge moyen des patients était de 33 ans (ET ± 17,4 ; IC à 95 % 22,5 à 43,5 ans). Six (46,2 %) cas présentaient des facteurs de risque associés à la KA ; quatre patients avaient un traumatisme oculaire et deux portaient des lentilles de contact. A. culbertsoni (6/13, 46,2 %) était l'espèce la plus commune, suivie par A. polyphaga et A. triangularis. La plupart des isolats (12/13) appartenaient au génotype T4 et un était un T12 ; trois sous-clusters T4A, T4B et T4F ont été identifiés dans le génotype T4. Il n'y avait pas d'association significative entre les types d'Acanthamoeba et les résultats cliniques. Huit (61,5 %) isolats abritaient des bactéries intracellulaires et un contenait Malassezia restricta. La présence de microbes intracellulaires était associée à une proportion plus élevée d'infiltrats stromaux (88,9 %, 8/9), d'anomalie épithéliale (55,6 %, 5/9) et d'hypopion (55,6 %, 5/9) par rapport à 50 % (2/ 4), 25 % (1/4) et 25 % (1/4) des cas de KA sans microbes intracellulaires, respectivement.

Le génotype T4 était l'isolat prédominant dans le sud de l'Inde. Il s'agit du deuxième rapport de génotype T12 identifié chez un patient AK en Inde, qui est rarement signalé dans le monde. La majorité des isolats cliniques d'Acanthamoeba dans cette étude abritaient des microbes intracellulaires, qui peuvent avoir un impact sur les caractéristiques cliniques de la KA.

Rapports d'examen par les pairs

La kératite à Acanthamoeba (KA) est une maladie oculaire rare représentant 2 % des infections cornéennes dans le monde [1]. Cependant, peut-être en raison de l'augmentation de l'utilisation des lentilles de contact et de la prévalence croissante des espèces d'Acanthamoeba dans différentes ressources en eau, y compris les piscines artificielles et même les approvisionnements en eau domestique traitée [2], les cas de KA augmentent à l'échelle mondiale. Le port de lentilles de contact augmente dans le monde entier en partie à cause du développement de lentilles de contact capables de contrôler la progression de la myopie chez les enfants, ce qui peut les exposer au risque de développer des infections AK pouvant entraîner la cécité [3]. Le lien entre la KA et le port de lentilles de contact est fermement établi, le port de lentilles de contact étant associé à près de 90 % des infections rapportées [4]. Les éclosions signalées ont été liées à des solutions désinfectantes pour lentilles de contact inefficaces [5, 6]. Le cycle de vie d'Acanthamoeba comprend un trophozoïte infectieux et le stade de kyste dormant; ce dernier pouvant rester viable pendant plusieurs années [7].

La KA est difficile à diagnostiquer et les schémas thérapeutiques efficaces sont très limités [8, 9]. Les kystes d'Acanthamoeba sont résistants aux désinfectants, aux médicaments anti-protozoaires et à l'épuisement des nutriments, ce qui représente un formidable défi pour les soins aux patients [10]. De plus, de nombreux médicaments courants pour traiter les infections oculaires ne sont pas efficaces contre Acanthamoeba. Comme le diagnostic et la prise en charge des patients AK sont difficiles, cela peut entraîner une longue médication et un traitement réussi devient extrêmement difficile, entraînant une perte de vision importante [11]. Des interventions chirurgicales sont nécessaires chez 30 % des patients atteints de KA pour contrôler la maladie et, dans de rares cas, l'œil infecté est retiré [12]. De plus, les kystes d'Acanthamoeba sont difficiles à éradiquer une fois l'infection établie, ce qui peut entraîner une récidive de l'infection [13]. Un diagnostic correct est essentiel pour un traitement réussi, mais comme les signes cliniques et les symptômes de la KA varient et que certains sont similaires à d'autres infections oculaires telles que la kératite à virus herpès simplex (HSV), le diagnostic peut être difficile. Le soulagement de la douleur, les anti-inflammatoires et les composés antimicrobiens généraux sont susceptibles d'être prescrits pendant que le diagnostic est établi. L'utilisation antérieure d'un corticostéroïde topique avant le diagnostic d'infection cornéenne à Acanthamoeba est associée à un moins bon résultat visuel [14]. Les KA avec une résistance suspectée aux solutions de lentilles de contact polyvalentes et aux remèdes anti-amibiens établis nécessitent des modalités de diagnostic sensibles avec de nouvelles approches thérapeutiques [15].

D'après la morphologie cellulaire, qui peut être influencée par les conditions de culture et la source d'isolement, Acanthamoeba spp. sont classés en 3 groupes, les kératites provoquant des souches appartenant le plus souvent au groupe II [7]. Au moins 23 génotypes (T1-T23) ont été identifiés sur la base de la séquence du gène de l'ARNr 18S d'Acanthamoeba et les espèces courantes de kératite telles que A. castellani et A. polyphaga appartiennent au clade T4 [16]. Les génotypes T2, T3, T5, T6, T10, T11, T12, T13, T15 et T16 ont également été récupérés chez des patients AK, bien que plus rarement [17, 18, 19]. Les variations inter-souches de la séquence du gène de la sous-unité d'ARNr 18S d'Acanthamoeba (rns) peuvent être utilisées pour identifier des génotypes sous-génériques [20].

Acanthamoeba est un protiste hétérotrophe pouvant héberger des bactéries, des champignons et des virus géants [21, 22]. Les co-infections d'Acanthamoeba avec d'autres agents pathogènes tels que Fusarium spp. ou Pseudomonas aeruginosa ont été observés chez des patients atteints de kératite [23]. Ces co-infections pourraient être dues au portage intracellulaire de ces pathogènes au sein de l'Acanthamoeba infectant. De plus, Acanthamoeba peut servir de terrain d'entraînement pour que les pathogènes bactériens envahissent les cellules eucaryotes supérieures [24]. Ce que l'on ne sait pas, c'est comment ces micro-organismes intracellulaires affectent le traitement et les résultats de la maladie AK, mais des études ont rapporté que la présence de microbes intracellulaires améliore la pathogénicité des isolats d'Acanthamoeba [25, 26]. Dans la présente étude, 13 isolats d'Acanthamoeba récupérés chez des patients AK dans le sud de l'Inde ont été examinés pour évaluer la distribution épidémiologique des génotypes et sous-génotypes d'Acanthamoeba rns et leurs manifestations cliniques. La présence de bactéries et de champignons intracellulaires dans les isolats d'Acanthamoeba a été évaluée et des déterminations ont été faites pour savoir si ceux-ci étaient associés aux résultats cliniques des patients atteints de KA.

Une étude de série de cas rétrospective en milieu hospitalier a été menée à partir de dossiers hospitaliers et de souches d'Acanthamoeba isolées au LV Prasad Eye Institute (LVPEI), Hyderabad, Inde de février à octobre 2020. Ce protocole d'étude a été examiné et approuvé par le comité d'examen institutionnel de LVPEI, Hyderâbâd (LEC-BHR-R-09–21-758). Treize isolats d'Acanthamoeba récupérés chez des patients AK ont été inclus dans cette étude.

Au cours de la période d'étude, conformément au protocole institutionnel, tous les patients présentant des caractéristiques cliniques de kératite microbienne ont subi un examen complet à la lampe à fente pour l'investigation du défaut épithélial cornéen, la taille de l'infiltrat (le cas échéant), la taille de l'hypopyon, l'implication de la sclère, absence/présence de particules étrangères et documentation du statut annexiel oculaire [27]. L'investigation microbiologique des grattages cornéens comprenait la préparation d'un frottis pour la microscopie à l'aide d'une coloration de Gram et d'hydroxyde de potassium avec un montage au calcofluor blanc (KOH + CFW), et l'inoculation dans des milieux appropriés [gélose au sang de mouton à 5 % (BA), gélose au chocolat (CA), Sabouraud gélose au dextrose (SDA), gélose au dextrose de pomme de terre (PDA), gélose non nutritive avec Escherichia coli (NNA), bouillon au thioglycolate et bouillon d'infusion cœur-cervelle (BHI)]. Le frottis et l'inoculation de tous les milieux ont été effectués (comme c'est la norme) par le clinicien traitant à la lampe à fente. Les milieux de culture déshydratés ont été fournis par HiMedia, Mumbai, Inde et fraîchement préparés en interne pour être utilisés. Des lentilles de contact bandage (2/13) ont été coupées aseptiquement en petits morceaux et inoculées dans BA, CA, SDA, NNA et BHI dans le laboratoire de microbiologie. Tous les milieux ont été incubés en aérobiose à 37 °C à l'exception du SDA et du PDA à 27 °C et de la gélose au chocolat qui a été incubée dans 5 % de CO2 à 37 °C. Les milieux ont été observés pendant 14 jours pour toute croissance. Les isolats d'Acanthamoeba provenant du raclage cornéen de 13 patients ont été confirmés par l'observation de trophozoïtes actifs et de kystes polygonaux à double paroi ; les isolats confirmés ont été conservés sur NNA et transportés à l'École d'optométrie et des sciences de la vision, Faculté de médecine et de santé, UNSW, Sydney, Australie. La thermotolérance des isolats a été évaluée en cultivant des isolats à 28 °C, 37 °C, 40 °C et 42 °C. Après l'isolement initial, les souches d'Acanthamoeba ont été cultivées de manière axénique dans un milieu peptone levure glucose (PYG) [28]. Chaque plaque de culture a été surveillée pour s'assurer qu'aucun microbe extracellulaire ou contamination n'était présent. Pour éviter une éventuelle contamination, le milieu de culture a été remplacé par du PYG fraîchement préparé tous les deux jours jusqu'à ce que les trophozoïtes soient récoltés. De plus, un incubateur stérile séparé réglé à 32 ° C a été utilisé pour cette étude.

Les souches d'Acanthamoeba ont ensuite été identifiées par dosage PCR. Les cellules amibiennes cultivées sur NNA ont été collectées dans 500 µL de PBS 1X (NaCl 1,4 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM et KH2PO4 1,8 mM, pH 6,9) à l'aide d'un grattoir stérile (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). L'ADN génomique (ADNg) a été extrait à l'aide d'une solution de lyse Chelex à 10 % v/v (Bio-Rad, CA, États-Unis) dans du Triton X-100 à 0,1 % v/v (Sigma-Aldrich) et du tampon Tris, pH 8,0 (Thermo Fisher Scientific, Bedford, USA), comme expliqué précédemment [29]. La quantité d'ADNdb extrait a été mesurée à l'aide du spectrophotomètre UV-Vis Nano Drop (Thermo Fisher Scientific) et les flacons d'ADNg ont été stockés à -20 ° C jusqu'à leur utilisation ultérieure.

La région du gène rns de l'ARNr 18S a été amplifiée dans une réaction PCR à l'aide d'amorces spécifiques au genre Acanthamoeba, JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') et JDPRv (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3'), qui codent pour la région DF3 hautement variable et donnent amplicons de ~ 450 pb [30]. Chaque test PCR a été réalisé dans 12,5 µL de DreamTaq Master Mix (ADN polymérase, tampon DreamTaq 2X, dATP, dCTP, dGTP et dTTP : 0,4 mM chacun et 4 mM MgCl2 ; Thermo Fisher Scientific), 1 µL de chaque amorce (10 µM) , 6,5 µL d'eau de qualité moléculaire et 4 µL de matrice d'ADN. L'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur T100 à 96 puits (Bio-Rad, Californie, USA) en utilisant les conditions de cyclage thermique suivantes : 95 °C pendant 5 min pour la dénaturation initiale, suivis de 35 cycles d'amplification (94 °C pour 30 s, 56 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 45 s) et une extension finale à 72 °C pendant 10 min [31]. Les amplifications PCR ont été observées par électrophorèse d'aliquotes de produit PCR de 4 μL dans un gel d'agarose à 1% et les bandes d'amplicon ont été examinées à l'aide de Gel Doc XR + avec un logiciel de laboratoire d'image (Bio-Rad). Des amplicons positifs à la PCR ont été envoyés au Ramaciotti Center for Genomics (UNSW, Sydney, Australie) pour le séquençage Sanger. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide d'un kit EXOSAP-IT (Thermo Fisher Scientific) et le séquençage a été effectué avec l'amorce directe JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') en utilisant le mélange réactionnel BigDye Terminator (V3.1) dans un analyseur d'ADN 3730 (Applied Biosystems, Massachusetts, États-Unis).

Les séquences de nucléotides de faible qualité ont été vérifiées manuellement et ajustées avec le logiciel Chromas (2.6.6) (Technelysium Pty Ltd, Brisbane, Australie) [32]. Les lectures de séquences découpées ont été extraites dans la base de données de séquences de nucléotides du NCBI (BLASTn) pour identifier les génotypes et les espèces d'Acanthamoeba. De plus, des souches isolées d'Acanthamoeba ont été caractérisées morphologiquement en espèces sur la base du schéma de classification de Pussard et Pons [33]. Toutes les lectures de séquence confirmées et validées ont été soumises au référentiel de données de séquence GenBank. Des séquences de nucléotides accessibles au public des génotypes d'Acanthamoeba ont été extraites du NCBI en tant que souches de référence pour l'analyse phylogénétique (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Les séquences ont été alignées à l'aide de l'algorithme ClustalW et un arbre phylogénétique a été construit à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance et de l'approche bayésienne avec les paramètres de Kimura-2 par 1 000 bootstraps dans MEGA-X [34] et l'arbre phylogénétique a été visualisé à l'aide de l'arbre de vie interactif (iTOLv6) [ 35].

Les Acanthamoeba ont été cultivées de manière axénique et maintenues dans du PYG (glucose de levure peptonée, pH 6,5) [36]. Tous les isolats ont été ensemencés dans des puits séparés d'une plaque de culture à 24 puits avec du milieu PYG (500 µL/puits) et incubés statiquement à 28 °C jusqu'à ce que les trophozoïtes forment des couches confluentes à 90 % au fond de chaque puits. Des aliquotes de PYG ont été inoculées sur de la gélose trypticase soja (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) et incubées à 37 ° C pendant 48 h. A la fin de l'incubation, les plaques de gélose ont été examinées pour la croissance de toute bactérie. Avant la collecte des trophozoïtes, le milieu PYG a été doucement remplacé par 1 mL de PBS contenant de la gentamicine (100 μg/mL) pour tuer toutes les bactéries extracellulaires et la plaque a été placée sur de la glace avec une légère agitation pour déloger les trophozoïtes adhérents. Le réactif TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, New York, États-Unis) a été utilisé pour l'extraction complète de l'ADNg en suivant la méthode de séparation phénol-chloroforme conformément au protocole du fabricant. La méthode a été légèrement modifiée pour exclure l'ajout d'EDTA qui peut interférer avec le test PCR en séquestrant les ions Mg2+ [37]. Pour améliorer la récupération de l'ADNg, des suspensions cellulaires traitées au TRIzol ont été passées 10 fois à travers des aiguilles de seringue 25G (BD, New Jersey, USA) pour lyser les cellules amibiennes.

Le gène de l'ARNr 16S (région V4) des bactéries intracellulaires a été amplifié à l'aide de l'amorce de l'ARNr 16S des eubactéries ; 515Fw/806Rv : Fw (5′- CCTACGGGNGCWGCAG-3′) et Rv (5' – GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) [38]. L'ADN génomique d'E. coli ATCC 10 798 et de l'eau sans nucléase ont été inclus comme témoins positifs et négatifs, respectivement. La présence de champignons intracellulaires a été évaluée à l'aide d'amorces ITS1Fw directes spécifiques aux champignons (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') et d'amorces inverses ITS4Rv (5'-CCTCCGCTATTGATATGC-3') ciblant les séquences conservées des ADNr 18S et 28S [39]. Un isolat clinique de Candida albicans a été inclus comme contrôle et le champignon intracellulaire a été identifié par séquençage Sanger de l'amplicon PCR.

Afin de visualiser les bactéries ou champignons intracellulaires, la FISH en combinaison avec la microscopie confocale a été réalisée selon un protocole précédent [40]. En bref, 1 ml de cellules amibiennes (> 90% de trophozoïtes) cultivées de manière axénique ont été collectées dans des tubes Eppendorf de 1, 5 ml et centrifugées pendant 5 min à 3 000 g pour récolter les trophozoïtes. Le culot cellulaire a été lavé deux fois avec une solution saline 1X Page et 30 µL de suspension amibienne ont été transférés sur des lames recouvertes de poly-l-lysine (Thermo Scientific, Braunschweig, Allemagne) et laissés pendant 30 min à température ambiante. Les cellules adhérentes ont été fixées en appliquant 30 µL de formaldéhyde à 4 % fraîchement préparé (tamponné, pH 6,9) pendant 25 min. Les cellules amibiennes attachées ont été lavées avec du PBS 1X, déshydratées à des concentrations croissantes d'éthanol (50 %, 80 % et 96 %, 3 min chacune) et séchées à l'air. Les bactéries intracellulaires ont été examinées par hybridation à l'aide de la sonde EUB338 spécifique au domaine bactérien marquée au Cy3 [41], et les champignons à l'aide de la sonde spécifique au champignon PF2 conjuguée à Hex et une sonde EUK516 marquée au Cy5 (tableau 1) [42] pour l'ARNr eucaryote 18S (biomères , Ulm, Allemagne). Des aliquotes (1 µL de 50 ng/µL) de chaque sonde ont été mélangées avec 9 µL de tampon d'hybridation (20 mM Tris–HCl, pH 7,1, 900 mM NaCl et 20 % v/v formamide, 0,01 % SDS) et ajoutées à la solution fixe. cellules amibiennes sur lames. L'hybridation a été effectuée pendant au moins 90 min à 46 °C dans l'obscurité, après quoi les lames ont été rincées avec 20 µL de tampon préchauffé (48 °C) (NaCl 180 mM, Tris/HCl 20 mM, pH 7,2 et 0,01 % FDS). Les lames ont ensuite été recouvertes de 200µL de tampon et une étape de lavage a été réalisée à 48°C pendant 25 min. Toutes les lames ont été rapidement immergées dans de l'eau MilliQ glacée, séchées à l'air et montées à l'aide de Prolong Diamond Antifade avec DAPI (Thermo Fisher Scientific), puis les lames montées ont été laissées pendant la nuit pour durcir à température ambiante dans l'obscurité avant l'imagerie. Trois tests indépendants ont été effectués et au moins 30 cellules hôtes amibiennes ont été visualisées au microscope confocal à balayage laser Olympus FV1200 dans l'installation de microscopie optique Katharina Gaus de l'UNSW et les images FISH ont été analysées dans ImageJ [43].

Les caractéristiques démographiques et cliniques des 13 patients AK ont été récupérées dans une fiche technique personnalisée à partir des dossiers hospitaliers et ont été examinées pour les caractéristiques suivantes : acuité visuelle initiale et finale ; symptômes signalés ; durée, taille et caractéristiques des infiltrats et défauts épithéliaux (certaines mesures ont été retranscrites à partir d'images cliniques) ; traitement antérieur (défini comme les médicaments utilisés avant la première présentation des patients au LVPEI) ; schémas thérapeutiques cliniques et durée de prise en charge au LVPEI ; besoin de chirurgie; résultat du traitement ; profession des patients; et ont rapporté des facteurs de risque de KA [45].

L'analyse des données a été effectuée dans le logiciel SPSS version 26.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Les proportions ont été présentées en pourcentage et la moyenne ± écart-type a été calculée pour les données continues. Un intervalle de confiance (IC) à 95 % a été calculé pour les données démographiques et cliniques en utilisant la proportion (p) ± 1,96* SEM (erreur standard de la moyenne). L'exact de Fisher et le chi carré ont été utilisés pour comparer les données démographiques et cliniques avec le statut d'endosymbionte avec le niveau de signification de la valeur P <0, 05 pour les tests bilatéraux.

Parmi les 13 patients AK, le plus grand nombre de cas (30,8 %, 4 patients AK) a été observé en février (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1). Les patients provenaient de six États différents de l'Inde ; cinq provenaient du Telangana, trois du Maharashtra, deux de l'Andhra Pradesh et un du Rajasthan, de l'Uttar Pradesh et du Tripura (Fig. 1).

Carte montrant les états des patients AK et de l'hôpital LVPEI en Inde. La carte a été créée à l'aide d'ArcGIS (Esri GIS, Californie, États-Unis). AP Andhra Pradesh, MA Maharashtra, RA Rajasthan, TE Telangana, TR Tripura, UP Uttar Pradesh

L'identification des souches d'Acanthamoeba et leur croissance à différentes températures sont présentées dans le tableau 2. Sept isolats (53,8 %) ont poussé à 40 °C et 42 °C, démontrant la thermotolérance de certaines souches qui causent la KA. La figure 2 montre les trophozoïtes (1A et 1B) et les kystes (1C-1E) d'un isolat d'Acanthamoeba (L-2483/20). La figure 3 montre l'image sur gel d'agarose des produits de PCR de la région DF3 du gène de l'ADNr 18S amibien et de l'ARNr 16S bactérien. Toutes les amibes ont été confirmées comme étant des Acanthamoeba, dont huit (61,5 %, 8/13) hébergeaient des bactéries intracellulaires et un isolat (L-2429/20) contenait des champignons. Aucune bactérie ne s'est développée à partir des aliquotes de PYG cultivées sur de la gélose trypticase soja, ce qui suggère que toute bactérie identifiée dans les expériences FISH était très susceptible d'être localisée de manière intracellulaire.

Structures des trophozoïtes d'Acanthamoeba (A) avec des acanthopodes, les flèches indiquent des projections en forme d'aiguille sur la surface cellulaire. B, image confocale des noyaux des trophozoïtes colorés au DAPI. C, D, phases d'enkystement de la souche L-1326/20 du pré-kyste (C, D) aux kystes polygonaux à double paroi (E), les flèches indiquent les kystes polygonaux d'Acanthamoeba. Barre d'échelle, 10 µm

Image recadrée sur gel d'agarose d'amplicons PCR d'isolats d'Acanthamoeba et de bactéries intracellulaires. Les bandes ont été visualisées en utilisant une électrophorèse sur gel à 1 % ; les paires d'amorces JDPFw/Rv et 515Fw/806Rv ont donné des amplicons d'environ 450 bp et d'environ 293 bp, respectivement. A. castellanii (ATCC 30868) et E. coli (ATCC 10798) ont été utilisés comme contrôle positif pour les réactions de PCR d'ARNr 18S et d'ARNr 16S et de l'eau sans nucléase a été utilisée comme contrôle négatif. Les images de gel en taille réelle sont incluses dans le fichier supplémentaire 1 (Figs. 4 et 5)

Arbre phylogénétique déduit des séquences d'ARNr 18S des isolats d'Acanthamoeba. L'arbre a été créé à l'aide de l'approche de jonction de voisins avec le paramètre Kimura 2 basé sur 1 000 valeurs bootstrap répliquées. Les isolats d'Acanthamoeba (de couleur bleue) de cette étude formaient deux clades génotypiques majeurs ; T4 était le génotype prédominant (trois sous-groupes : T4A, T4B et T4F) et T12 n'avait qu'un seul isolat, "*" désigne les espèces et les génotypes de référence du NCBI (de couleur violette)

Images représentatives du test FISH représentant les bactéries intracellulaires A et les champignons C des isolats d'Acanthamoeba. Une bactérie en forme de tige a été dispersée dans toutes les cellules amibiennes de la population qui a été détectée à l'aide de la sonde EUB338 (L-579/20, indiquée par des flèches rouges). B Trophozoite d'Acanthamoeba (L-552/20) sans bactéries ni champignons intracellulaires. C De grandes cellules fongiques ovoïdes ont été observées dans la souche Acanthamoeba à l'aide de la sonde PF2 (L-2429/20, indiquée par des flèches jaunes). Barre d'échelle, 12 µm

La séquence nucléotidique partielle de la région DF3 de l'ADNr 18S amibien a été alignée à l'aide de l'algorithme ClustalW et a montré la variation de séquence nucléotidique inter-souche la plus élevée (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2). L'analyse phylogénétique voisine de 13 isolats a formé deux clades principaux, la plupart des isolats (12/13, 92,3 %) appartenant au génotype T4 (L-552/20, L-1133/20, L-1257/20, L- 2482/20, L-2483/20, L-2487/20 : A. culbertsoni ; L-579/20, L-1326/20 : A. polyphaga ; L-1137/20, L-2429/20 : A. triangularis, et L-604/20, L-1765/20 : Acanthamoeba spp. T4) et un isolat (L-2391/20) étant de génotype T12 (A. healyi ; Tableau 2 et Fichier complémentaire 1 : Tableau S2). Parallèlement à la morphologie du kyste, la séquence produisant l'alignement le plus élevé (% d'identité) avec les séquences dans le NCBI des espèces et génotypes existants d'Acanthamoeba a été attribuée à chaque isolat. Pour deux isolats (L-604/20 et L-1765/20), la morphologie du kyste n'était pas évidente pour une espèce particulière d'Acanthamoeba, mais le dynamitage des nucléotides NCBI et l'analyse phylogénétique ont confirmé que les deux souches appartenaient au génotype T4. Le génotype T12 a été détecté chez un agriculteur du Maharashtra sans antécédent de traumatisme oculaire ; deux autres cas du même état étaient infectés par le génotype T4. Les dix isolats restants de variants T4 ont été récupérés chez des patients AK de l'Andhra Pradesh, du Rajasthan, du Telangana, du Tripura et de l'Uttar Pradesh (fichier supplémentaire 1 : carte S1). Dans le clade T4 prédominant, les isolats formaient trois sous-clusters, T4A (1 isolat), T4B (10 isolats) et T4F (1 isolat). La séquence nucléotidique des 13 isolats a été déposée auprès de GenBank sous les numéros d'accession OK042094 à OK042106 (tableau 2). Du génotype T4B, 6 patients étaient infectés par A. culbertsoni, 2 par A. polyphaga et un par A. triangularis ou Acanthamoeba spp. Un patient était infecté par T12 A. healyi et un autre patient (L-1765/20) était infecté par T4A Acanthamoeba spp. (Fig. 4).

Parmi les 13 isolats d'Acanthamoeba, 9 (69,2 %) étaient positifs pour les microbes intracellulaires avec huit bactéries abritant (Fig. 3) et un isolat (L-2429/20) abritant le champignon Malassezia restricta (fichier supplémentaire 1 : Fig. S3). Pour les huit isolats hébergeant des bactéries, des bactéries intracellulaires en forme de bâtonnet ont été observées dans tout le cytoplasme, et les bactéries étaient présentes dans toutes les cellules d'Acanthamoeba de la population observée. Aucune bactérie extracellulaire n'a été observée, comme prévu en raison du protocole. M. restricta a été observé sous forme de cellules vertes de forme ovale dans l'isolat d'Acanthamoeba (Fig. 5).

La durée moyenne des symptômes des patients AK infectés par Acanthamoeba avec des bactéries ou des champignons intracellulaires était de 43, 0 ± 44, 3 jours, contre 16, 5 ± 5, 1 jours pour les patients infectés par Acanthamoeba sans endosymbionte (tableau 3). Parmi ces neuf cas de KA, six avaient des antécédents de traumatisme oculaire (n = 4) ou de port de lentilles de contact (n = 2) et trois étaient des agriculteurs. Une forme sévère de KA avec infiltrat stromal (88,9 %, 8/9) et hypopyon (55,6 %, 5/9) a été notée en présence d'endosymbiontes amibiens et cinq cas présentaient à la fois un infiltrat stromal et un hypopyon. Cependant, ces différences dans l'infiltrat stromal (p = 0,2) et l'hypopyon (p = 1,0) n'étaient pas significativement plus fréquentes chez les patients AK avec des endosymbiontes amibiens que chez ceux sans endosymbiontes. Fait intéressant, une durée de traitement médical plus longue (médiane, IQR : 75,0, 43,5–202,5 vs 30,0, 17,0–91,8 jours) a été observée chez les patients sans endosymbiontes Acanthamoeba (p = 0,2). En présence d'endosymbiontes, la proportion de patients avec un ulcère cicatrisant (66,6 %) ou une amélioration de l'AV final (44,4 %) était plus faible par rapport à ceux sans endosymbiontes (respectivement 75 % et 50 %) (p > 0,05). Deux patients (25 %, 2/8) infectés par Acanthamoeba avec des endosymbiontes bactériens avaient reçu des antibiotiques ainsi que des médicaments antiamibiens et les ulcères des deux cas ont été résolus après la médication.

La plupart des patients atteints de KA étaient des agriculteurs (5/13) ou des étudiants (5/13) et les facteurs de risque rapportés associés à la KA étaient les traumatismes oculaires (4 cas ; 30,8 % ; IC à 95 % = 9,1 à 61,4) et le port de lentilles de contact ( 2 cas ; 15,4 % ; IC 95 % = 1,9—45,5). Une KA unilatérale a été rapportée dans 12 cas (92,3 %). La majorité des patients atteints de KA avaient une vision réduite (84,6 %) comme symptôme majeur suivi de douleurs oculaires (69,2 %), de rougeurs (69,2 %), de larmoiements (53,8 %) et de taches blanches sur la cornée (15,4 %). Un infiltrat annulaire caractéristique typique de l'AK (> 4 mm) a été observé dans 3 (23,1 %) cas. Un défaut épithélial était noté dans 6 cas (46,2 % ; 6,2 ± 1,7 mm), des infiltrats stromaux dans 10 cas (76,9 % ; 5,0 ± 2,2 mm) et un hypopion dans 6 cas (46,1 % ; 1,12 ± 0,6 mm). La durée médiane d'apparition des symptômes était de 20 jours (IQR = 15—30) et l'acuité visuelle finale n'était pas améliorée de ≥ 2 lignes chez les patients issus de l'agriculture (5/5, 100 %), âge > 32 ans (4/6 , 80 %) et les patients présentant des symptômes de KA depuis plus de 20 jours (3/6, 50 %) (Fichier complémentaire 1 : Tableau S3). Le PHMB et la chlorohexidine étaient les traitements les plus fréquents dans cette étude (11 cas ; 84,6 %). Trois cas ont reçu des antibiotiques, un cas un antiviral et un cas un antifongique comme thérapie de soutien (38,5 %) ; pour ceux-ci, il n'y a pas eu d'amélioration (p > 0,05) de la MAVC à la présentation finale par rapport aux cas traités uniquement avec du PHMB et de la chlorohexidine. Globalement, la durée médiane du traitement médical était de 38 jours (IQR = 23—90). Sur six cas avec traitement chirurgical, 4 cas ont eu une kératoplastie pénétrante thérapeutique (TPK, n = 4), dont un cas qui a eu une greffe de membrane amniotique (Tableau 4). Sur les deux cas restants, un a eu une thérapie antimicrobienne photodynamique avec du rose Bengale (RB-PDAT) et un a subi une éviscération. Parmi 6 patients ayant dû subir une chirurgie oculaire, 66,7 % (4/6) étaient infectés par des souches d'Acanthamoeba à bactéries intracellulaires.

Treize isolats cliniques d'Acanthamoeba spp. d'Hyderabad, en Inde, ont été génotypés et les présentations cliniques associées aux patients AK ont été analysées. T4 était le génotype le plus courant (92,3 %), comme cela a été rapporté dans le monde entier [45, 46, 47, 48]. A. culbertsoni (6, 46,2%) était l'espèce prédominante parmi le génotype T4, et cela a déjà été signalé en Inde [45]. Un isolat récupéré chez un patient sans facteur de risque préexistant appartenait au clade T12, qui a rarement été isolé des cas de KA [19].

L'étude actuelle soutient que la kératite prédominante causant le génotype T4 est également répandue dans plusieurs États (Andhra Pradesh, Maharashtra, Rajasthan, Telangana, Tripura et Uttar Pradesh) de l'Inde. À la connaissance des auteurs, il ne s'agit que du deuxième signalement du génotype A. healyi T12 d'une infection cornéenne en Inde [45]. Un cas grave de KA causé par le génotype T12 a été signalé à Bangkok, en Thaïlande [19], où le patient avait des antécédents d'exposition à un produit chimique corrosif et avait utilisé de l'eau du robinet pour se rincer l'œil infecté. Parmi les souches T4 (92,3 %, 12/13), la majorité étaient des T4B (83,3 %, 10/12), avec un isolat de T4A et de T4F. Une précédente étude indienne a rapporté 13 souches (50%) du sous-cluster T4B à partir de 26 isolats, les autres étant T4A (deux isolats), T4D (10 isolats) et T4E (un isolat) [45]. T4A (38%) était le principal sous-génotype des isolats d'Acanthamoeba récupérés chez des patients chiliens AK, suivi de T4B, T4G, T4C et T4D [46]. Parmi les souches T4, d'autres variants de DF3 tels que T4E, F, G, I, J, N, O, P, V et X associés à des infections cornéennes ont été rapportés dans différents pays [46, 49, 50]. Ces résultats impliquent une différence géographique entre les isolats T4 causant la KA, mais cela nécessite une enquête plus approfondie.

L'incidence de la KA est en constante augmentation dans le monde avec environ 90 % des cas associés aux lentilles de contact dans les pays développés [49]. Bien que le port de lentilles de contact ne soit pas couramment associé à la KA en Inde et dans d'autres pays en développement, [45, 51] l'augmentation mondiale de la myopie et l'utilisation de lentilles de contact pour prévenir la myopie, les objectifs cosmétiques et les activités sportives ont augmenté le risque de KA, en particulier chez les jeunes [1]. Comme observé dans la présente étude, les traumatismes oculaires et le contact avec un sol ou de l'eau contaminés sont les principaux facteurs de risque prédisposant à l'infection KA non liés au port de lentilles de contact [52, 53, 54]. Les lésions oculaires avec des particules de poussière ou des matières végétatives étaient le facteur de risque le plus fréquemment rapporté chez les patients KA du centre de la Chine (52,1 %) [55] et du sud de l'Inde (48,7 %) [52].

L'AV finale n'a pas été améliorée de 2 lignes ou plus parmi les agriculteurs (100%), les patients âgés de > 32 ans (80%) et les cas présentant des symptômes de kératite depuis > 20 jours (50%). Une étude britannique a également rapporté les pires résultats cliniques pour les patients AK âgés de plus de 34 ans [56]. L'intégrité cornéenne s'affaiblit avec l'âge et l'incidence plus élevée de sécheresse oculaire chez les populations âgées peut être un facteur prédisposant possible à la forme sévère de KA [9]. Une étude antérieure de la kératite bactérienne du LVPEI soutient l'association de la taille du défaut épithélial avec la perte d'AV trouvée dans l'étude actuelle [57]. Les professions des patients sont souvent liées aux facteurs de risque [55]. Dans la présente étude, parmi cinq cas ayant des antécédents agricoles, quatre (80 %) avaient des antécédents de traumatisme oculaire pouvant avoir été causé par des matières externes non stériles car les encadreurs sont fréquemment exposés à des activités de plein air et trois patients (75 %, 3/ 5) ont été infectés par des souches d'Acanthamoeba avec des bactéries intracellulaires. Les quatre cas ont dû subir une chirurgie oculaire mais l'acuité visuelle n'a pas été améliorée même après la récupération postopératoire. Un traumatisme oculaire avec des objets contaminés peut être un véhicule idéal pour l'invasion des cellules d'Acanthamoeba conduisant à une forme sévère de KA. Environ 90 % des patients atteints de KA ayant des antécédents de lésions oculaires ont eu des greffes de cornée pour restaurer la vision dans le sud de la Chine [58].

Parmi les 13 isolats d'Acanthamoeba, 8 (61,5 %) possédaient des bactéries intracellulaires, ce qui est très similaire aux 59,4 % d'Acanthamoeba possédant des bactéries intracellulaires dans une étude menée aux États-Unis [25], mais plus de deux à trois fois plus élevé que les souches aux États-Unis. Type Culture collection [26] ou une étude plus ancienne (1993) des États-Unis qui n'utilisait que des techniques de coloration traditionnelles pour révéler les microbes intracellulaires [59]. Des bactéries intracellulaires appartenant aux genres Pseudomonas, Legionella, Chlamydia et Mycobacterium ont été détectées dans des isolats d'Acanthamoeba récupérés dans des cas de KA aux États-Unis [25], tandis que Rickettsiales, Mycobacterium et Parachlamydia spp. ont été détectés dans des souches ATCC isolées d'écouvillons nasaux humains, de cornée et de sédiments lacustres, respectivement [26]. Fritsche et al. [59] ont observé des bactéries en forme de bâtonnets et de coques dans des souches environnementales (24 %) et cliniques (26 %) d'Acanthamoeba provenant de différents endroits. La co-occurrence de microbes intracellulaires phylogénétiquement divers dans une cellule d'Acanthamoeba a été observée [60] ; Aspergillus spp., P. aeruginosa et HAdV (adénovirus humain) ont été détectés dans un isolat clinique d'Acanthamoeba en Iran [61]. À notre connaissance, il s'agit du premier rapport décrivant M. restricta comme un endosymbionte d'Acanthamoeba. Le patient était un agriculteur avec des antécédents de traumatisme oculaire avec un agent chimique et l'ulcère cornéen n'a pas été résolu avec un traitement médical utilisant du PHMB et de la chlorhexidine pendant un mois. La co-infection par Acanthamoeba et Malassezia n'a pas été décrite chez les patients atteints de KA, mais M. restricta a rarement provoqué une kératite fongique [62]. D'autres études ont rapporté des kératites dues à la co-infection d'Acanthamoeba avec des champignons tels que Cladosporium, Fusarium et Curvularia [23, 63, 64].

Les bactéries intracellulaires d'Acanthamoeba peuvent augmenter les dommages épithéliaux cornéens comme cela a été montré dans une étude clinique et un modèle cellulaire [25]. Bien que dans l'étude actuelle, il n'y ait pas eu de différences significatives dans les manifestations cliniques, la présence d'endosymbiontes bactériens était associée à une proportion plus élevée d'infiltrats stromaux (87,5 %), de défauts épithéliaux (62,5 %) et d'hypopyon (50 %). Sur la base des données actuelles, pour montrer un effet significatif de ces différences, un minimum de 54 sujets (test z pour la différence entre deux proportions indépendantes ; erreur α = 0,05, erreur 1-β = 0,8, score z = 1,95 et rapport d'allocation = 1:1) est requis dans les études futures (G*Power v3.1.9.7).

Dans l'étude actuelle, deux cas (25 %, 2/8) touchés par Acanthamoeba avec des endosymbiontes bactériens avaient reçu des antibiotiques (ciprofloxacine et doxycycline) ainsi que des médicaments antiamibiens topiques et l'ulcère des deux cas s'est résolu après le traitement. Les cas restants de KA avec des bactéries intracellulaires ont guéri lorsqu'ils ont été traités uniquement avec du PHMB et de la chlorhexidine. Ceci est attendu car ces antiseptiques sont également efficaces contre les bactéries [65]. L'ajout d'antibiotiques peut être avantageux à la chimiothérapie antiamibienne pour abroger les traits augmentant la virulence des bactéries intracellulaires [26]. D'autre part, la libération d'endosymbiontes après la mort de l'hôte amibien dans une cornée compromise peut augmenter l'inflammation et aggraver les résultats cliniques. À l'heure actuelle, on ne sait pas entièrement si les remèdes auxiliaires au traitement anti‐amibien tels que les antibiotiques sont efficaces par rapport aux médicaments anti‐amibiens seuls [66] et le rôle des endosymbiontes au cours des infections amibiennes n'a pas encore été pleinement exploré [25]. La taille de l'échantillon de l'étude actuelle peut être insuffisante pour évaluer les différences cliniquement significatives entre ces deux groupes. Pourtant, en tant qu'étude de référence avec des données pilotes, cette étude est précieuse à des fins épidémiologiques et taxonomiques de la kératite à Acanthamoeba. De futures études sont nécessaires pour examiner l'impact des endosymbiontes amibiens sur la pathogénicité de l'hôte, la sensibilité aux médicaments, les résultats cliniques et les avantages de l'ajout d'adjuvants antibactériens à la chimiothérapie antiamibienne standard avec une cohorte plus élevée et un suivi prolongé des patients AK.

Cette étude confirme que les isolats de kératite à l'origine d'Acanthamoeba étaient principalement de génotype T4 suivi de T12, avec trois variantes sous-génomiques T4A, T4B et T4F identifiées dans le génotype T4 prédominant. Il n'y avait aucune association significative entre les espèces et/ou les génotypes d'Acanthamoeba et les résultats cliniques d'un patient. Dans l'étude actuelle, un nombre élevé de souches d'Acanthamoeba avec des endosymbiontes ont été observées et bien qu'il n'y ait pas de relation claire avec les résultats cliniques, les endosymbiontes d'Acanthamoeba peuvent être impliqués dans la formation de la virulence, de la survie et de la sensibilité aux médicaments de l'hôte amibien.

Les données cliniques des patients AK sont disponibles dans des feuilles Excel et SPSS qui peuvent être obtenues auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Le numéro d'accès GenBank attribué à la séquence nucléotidique allait de OK042094 à OK042106 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=OK042094:OK042106[accn]).

Kératite à Acanthamoeba

Acanthamoeba Amplificateur spécifique

Meilleure acuité visuelle corrigée

Désoxynucléoside triphosphate

Fragment diagnostique 3

Institut des yeux LV Prasad

Biguanide de polyhexaméthylène

Gène de l'ARN ribosomal 18S de la petite sous-unité nucléaire

Gélose sans nutriments

Hybridation in situ par fluorescence

Réaction en chaîne par polymérase

Thérapie antimicrobienne photodynamique au rose bengale

Liste W, Glatz W, Riedl R, Mossboeck G, Steinwender G, Wedrich A. Évaluation des cas de kératite à Acanthamoeba dans un centre de soins médicaux tertiaires sur 21 ans. Sci Rep. 2021;11(1):1036.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carnt NA, Subedi D, Connor S, Kilvington S. La relation entre les sources environnementales et la sensibilité de la kératite à Acanthamoeba au Royaume-Uni. PLoS ONE. 2020;15(3):e0229681.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li W, Wang Z, Qu J, Zhang Y, Sun X. Kératite à Acanthamoeba liée à l'utilisation de lentilles de contact dans un hôpital tertiaire en Chine. BMC Ophtalmol. 2019;19(1):1–6.

Article Google Scholar

Mascarenhas J, Lalitha P, Prajna NV, Srinivasan M, Das M, D'Silva SS, et al. Acanthamoeba, kératite fongique et bactérienne: une comparaison des facteurs de risque et des caractéristiques cliniques. Suis J Ophthalmol. 2014;157(1):56–62.

Article PubMed Google Scholar

Bullock JD, Warwar RE. Kératite à Acanthamoeba et Fusarium associée à une solution de lentilles de contact. Urgence Infect Dis. 2010;16(9):1501.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Verani JR, Lorick SA, Yoder JS, Beach MJ, Braden CR, Roberts JM, et al. Épidémie nationale de kératite à Acanthamoeba associée à l'utilisation d'une solution pour lentilles de contact, États-Unis. Urgence Infect Dis. 2009;15(8):1236.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Siddiqui R, Khan NA. Biologie et pathogenèse d'Acanthamoeba. Vecteurs parasites. 2012;5(1):1–13.

Google Scholar

Rayamajhee B, Willcox MD, Henriquez FL, Petsoglou C, Carnt N. Kératite à Acanthamoeba : une maladie infectieuse de plus en plus courante de la cornée. Lancette Microbe. 2021. https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00093-8.

Article PubMed Google Scholar

Randag AC, van Rooij J, van Goor AT, Verkerk S, Wisse RPL, Saelens IEY, et al. L'incidence croissante de la kératite à Acanthamoeba : une enquête nationale sur 7 ans et une évaluation clinique des facteurs de risque et des résultats fonctionnels. PLoS ONE. 2019 ;14(9) : e0222092.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnston SP, Sriram R, Qvarnstrom Y, Roy S, Verani J, Yoder J, et al. Résistance des kystes d'Acanthamoeba à la désinfection dans plusieurs solutions pour lentilles de contact. J Clin Microbiol. 2009;47(7):2040–5.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lorenzo-Morales J, Khan NA, Walochnik J. Une mise à jour sur la kératite à Acanthamoeba : diagnostic, pathogenèse et traitement. Parasite. 2015. https://doi.org/10.1051/parasite/2015010.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Butler TK, Males JJ, Robinson LP, Wechsler AW, Sutton GL, Cheng J, et al. Examen de six ans de la kératite à Acanthamoeba en Nouvelle-Galles du Sud, Australie : 1997–2002. Expérience Clin Ophtalmol. 2005;33(1):41–6.

Article PubMed Google Scholar

Anwar A, Khan NA, Siddiqui R. Lutte contre Acanthamoeba spp. kystes : quelles sont les options ? Vecteurs de parasites. 2018;11(1):1–6.

Article Google Scholar

Robaei D, Carnt N, Minassian DC, Dart JK. L'impact de l'utilisation de corticostéroïdes topiques avant le diagnostic sur l'évolution de la kératite à Acanthamoeba. Ophtalmologie. 2014;121(7):1383–8.

Article PubMed Google Scholar

Kaufman AR, Tu EY. Avancées dans la prise en charge de la kératite à Acanthamoeba : revue de la littérature et approche algorithmique synthétisée. Ocul Surf. 2022;25:26–36.

Article PubMed Google Scholar

Putaporntip C, Kuamsab N, Nuprasert W, Rojrung R, Pattanawong U, Tia T, et al. L'analyse des génotypes d'Acanthamoeba provenant de sources publiques d'eau douce en Thaïlande révèle un nouveau génotype, T23 Acanthamoeba bangkokensis sp. Nov. Sci Rep. 2021;11(1):1–13.

Article Google Scholar

de Lacerda AG, kératite de Lira M. Acanthamoeba : examen de la biologie, de la physiopathologie et de l'épidémiologie. Ophtalmique Physiol Opt. 2021;41(1):116–35.

Article PubMed Google Scholar

Martín-Pérez T, Criado-Fornelio A, Martínez J, Blanco M, Fuentes I, Pérez-Serrano J. Isolement et caractérisation moléculaire d'Acanthamoeba chez des patients atteints de kératite en Espagne. Eur J Protistol. 2017;61:244–52.

Article PubMed Google Scholar

Satitpitakul V, Putaporntip C, Jongwutiwes S. Kératite sévère causée par le génotype T12 d'acanthamoeba en Thaïlande : à propos d'un cas. Am J Trop Med Hyg. 2021. https://doi.org/10.4269/ajtmh.21-0666.

Article PubMed Google Scholar

Schroeder JM, Booton GC, Hay J, Niszl IA, Seal DV, Markus MB, et al. Utilisation de la PCR et du séquençage de l'ADN ribosomal 18S subgénique pour l'identification du genre et du génotype des acanthamoebae d'humains atteints de kératite et de boues d'épuration. J Clin Microbiol. 2001;39(5):1903–11.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rayamajhee B, Subedi D, Peguda HK, Willcox MD, Henriquez FL, Carnt N. Un examen systématique des micro-organismes intracellulaires au sein d'Acanthamoeba pour comprendre l'impact potentiel de l'infection. Agents pathogènes. 2021;10(2):225.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brüssow H. Bactéries entre protistes et phages : des stratégies anti-prédation à l'évolution de la pathogénicité. Mol Microbiol. 2007;65(3):583–9.

Article PubMed Google Scholar

Joseph J, Chaurasia S, Sharma S. Rapport de cas : co-infection cornéenne avec champignon et amibe : rapport de deux patients et revue de la littérature. Am J Trop Med Hyg. 2018;99(3):805.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Molmeret M, Horn M, Wagner M, Santic M, Abu KY. Les amibes comme terrains d'entraînement pour les pathogènes bactériens intracellulaires. Appl Environ Microbiol. 2005;71(1):20–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iovieno A, Ledee DR, Miller D, Alfonso EC. Détection d'endosymbiotes bactériens dans des isolats cliniques d'acanthamoeba. Ophtalmologie. 2010;117(3):445–52.e4523.

Article PubMed Google Scholar

Purssell A, Lau R, Boggild AK. Atténuation par l'azithromycine et la doxycycline de la virulence de l'acanthamoeba dans un modèle de tissu cornéen humain. J Infect Dis. 2017;215(8):1303–11.

CAS PubMed Google Scholar

Gopinathan U, Sharma S, Garg P, Rao GN. Revue des caractéristiques épidémiologiques, diagnostic microbiologique et issue du traitement de la kératite microbienne : expérience de plus d'une décennie. Indien J Ophthalmol. 2009;57(4):273–9.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan LL, Mak JW, Low YT, Koh TT, Ithoi I, Mohamed SM. Isolement et caractérisation d'Acanthamoeba spp. des climatiseurs à Kuala Lumpur en Malaisie. Acta Trop. 2011;117(1):23–30.

Article PubMed Google Scholar

Iovieno A, Miller D, Lonnen J, Kilvington S, Alfonso EC. Extraction de l'ADN d'Acanthamoeba à l'aide de résine Chelex. J Clin Microbiol. 2011;49(1):476–7.

Article PubMed Google Scholar

Vodkin MH, Howe DK, Visvesvara GS, Mclaughlin GL. Identification d'Acanthamoeba aux niveaux générique et spécifique à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase. J Protozool. 1992;39(3):378–85.

Article CAS PubMed Google Scholar

Carnt NA, Subedi D, Lim AW, Lee R, Mistry P, Badenoch PR, et al. Prévalence et variation saisonnière d'Acanthamoeba dans l'eau du robinet domestique dans le Grand Sydney, Australie. Clin Exp Optom. 2020;103(6):782–6.

Article PubMed Google Scholar

BJ coincé. SeqTrace : un outil graphique pour traiter rapidement les chromatogrammes de séquençage d'ADN. JBT. 2012;23(3):90.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Pussard M, Pons R. Morphologies de la paroi kystique et taxonomie du genre Acanthamoeba (Protozoa, Amoebida). Protistologique. 1977;13:557–610.

Google Scholar

Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. MEGA X : analyse de la génétique évolutive moléculaire sur les plates-formes informatiques. Mol Biol Évol. 2018;35(6):1547.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letunic I, Bork P. Arbre de vie interactif (iTOL): un outil en ligne pour l'affichage et l'annotation d'arbres phylogénétiques. Bioinformatique. 2007;23(1):127–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Jensen T, Barnes WG, Meyers D. Culture axénique de grandes populations d'Acanthamoeba castellanii (JBM). J. Parasitol. 1970;56:904–6.

Article CAS PubMed Google Scholar

Huggett JF, Novak T, Garson JA, Green C, Morris-Jones SD, Miller RF, et al. Sensibilité différentielle des réactions PCR aux inhibiteurs : un phénomène important et méconnu. Notes de résolution BMC. 2008;1(1):1–9.

Article Google Scholar

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Lozupone CA, Turnbaugh PJ, et al. Modèles globaux de diversité d'ARNr 16S à une profondeur de millions de séquences par échantillon. Proc Natl Acad Sci. 2011;108(Supplément 1):4516–22.

Article CAS PubMed Google Scholar

De Beeck MO, Lievens B, Busschaert P, Declerck S, Vangronsveld J, Colpaert JV. Comparaison et validation de certaines paires d'amorces ITS utiles pour les études de métabarcodage fongique. PLOS ONE. 2014;9(6) : e97629.

Article Google Scholar

Daims H, Stoecker K, Wagner M. Hybridation in situ par fluorescence pour la détection des procaryotes. Mol Microb Écol. 2004. https://doi.org/10.1016/s1369-5274(03)00054-7.

Article Google Scholar

Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. Combinaison de sondes oligonucléotidiques ciblées sur l'ARNr 16S avec la cytométrie en flux pour l'analyse de populations microbiennes mixtes. Appl Environ Microbiol. 1990;56(6):1919–25.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amann R, Springer N, Schönhuber W, Ludwig W, Schmid EN, Müller K, et al. Parasites bactériens intracellulaires obligatoires des acanthamoebes apparentés à Chlamydia spp. Appl Environ Microbiol. 1997;63(1):115–21.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Fidji : une plate-forme open source pour l'analyse d'images biologiques. Méthodes Nat. 2012;9(7):676–82.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kempf VA, Trebesius K, Autenrieth IB. L'hybridation fluorescente in situ permet une identification rapide des micro-organismes dans les hémocultures. J Clin Microbiol. 2000;38(2):830–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prithiviraj SR, Rajapandian SGK, Gnanam H, Gunasekaran R, Mariappan P, Singh SS, et al. Présentations cliniques, diversité génotypique et analyse phylogénétique des espèces d'Acanthamoeba à l'origine de la kératite. JMed Microbiol. 2020;69(1):87–95.

Article CAS Google Scholar

Jercic MI, Aguayo C, Saldarriaga-Cordoba M, Muino L, Chenet SM, Lakes J, et al. Diversité génotypique des souches d'Acanthamoeba isolées de patients chiliens atteints de kératite à Acanthamoeba. Vecteurs parasites. 2019;12(1):5

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Booton GC, Kelly DJ, Chu YW, Seal DV, Houang E, Lam DS, et al. Typage et suivi de l'ADN ribosomal 18S des isolats d'espèces d'Acanthamoeba à partir d'échantillons de grattage cornéen, de lentilles de contact, d'étuis à lentilles et d'approvisionnement en eau à domicile de patients atteints de kératite à Acanthamoeba à Hong Kong. J Clin Microbiol. 2002;40(5):1621–5.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walochnik J, Scheikl U, Haller-Schober EM. Vingt ans de diagnostic d'acanthamoeba en Autriche. J Eucaryote Microbiol. 2015;62(1):3–11.

Article PubMed Google Scholar

Ledee DR, Iovieno A, Miller D, Mandal N, Diaz M, Fell J, et al. Identification moléculaire des génotypes t4 et t5 dans des isolats de patients atteints de kératite à acanthamoeba. J Clin Microbiol. 2009;47(5):1458–62.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang Y, Sun X, Wang Z, Li R, Luo S, Jin X, et al. Identification du génotype d'ADN ribosomique 18S d'Acanthamoeba chez des patients atteints de kératite dans le nord de la Chine. Investir Ophtalmol Vis Sci. 2004;45(6):1904–7.

Article PubMed Google Scholar

Garg P, Kalra P, Joseph J. Kératite à Acanthamoeba non liée aux lentilles de contact. J indien d'ophtalmologie. 2017;65(11):1079.

Article Google Scholar

Sharma S, Garg P, Rao GN. Caractéristiques des patients, diagnostic et traitement de la kératite à Acanthamoeba non liée aux lentilles de contact. J britannique d'ophtalmologie. 2000;84(10):1103–8.

Article CAS Google Scholar

Koltas IS, Eroglu F, Erdem E, Yagmur M, Tanır F. Le rôle de l'eau du robinet domestique sur la kératite à Acanthamoeba chez les porteurs de lentilles sans contact et validation des méthodes de laboratoire. Parasitol Res. 2015;114(9):3283–9.

Article PubMed Google Scholar

Sharma S, Srinivasan M, George C. Kératite à Acanthamoeba chez les porteurs de lentilles sans contact. Arch Ophtalmol. 1990;108(5):676–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Jiang C, Sun X, Wang Z, Zhang Y. Kératite à Acanthamoeba : caractéristiques cliniques et prise en charge. Ocul Surf. 2015;13(2):164–8.

Article PubMed Google Scholar

Carnt N, Robaei D, Minassian DC, Dart JKG. Kératite à Acanthamoeba chez 194 patients : facteurs de risque de mauvais pronostic et de complications inflammatoires sévères. Br J Ophthalmol. 2018;102(10):1431–5.

Article PubMed Google Scholar

Konda N, Garg P, Sharma S, Willcox MDP. Facteurs de risque de kératite microbienne liée aux lentilles de contact et de perte de vision associée dans une population du sud de l'Inde. Lentille de contact avec les yeux. 2021;47(2):118–26.

Article PubMed Google Scholar

Zhong J, Li X, Deng Y, Chen L, Zhou S, Huang W, et al. Facteurs associés, diagnostic et prise en charge de la kératite à Acanthamoeba dans un centre de référence du sud de la Chine. BMC Ophtalmol. 2017;17(1):175.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Fritsche TR, Gautom RK, Seyedirashti S, Bergeron DL, Lindquist TD. Présence d'endosymbiontes bactériens chez Acanthamoeba spp. isolé à partir d'échantillons cornéens et environnementaux et de lentilles de contact. J Clin Microbiol. 1993;31(5):1122–6.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmitz-Esser S, Toenshoff ER, Haider S, Heinz E, Hoenninger VM, Wagner M, et al. Diversité des endosymbiontes bactériens des isolats environnementaux d'Acanthamoeba. Appl Environ Microbiol. 2008;74(18):5822–31.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hajialilo E, Rezaeian M, Niyyati M, Pourmand MR, Mohebali M, Norouzi M, et al. Caractérisation moléculaire des endosymbiontes bactériens, viraux et fongiques des isolats d'Acanthamoeba chez les patients kératites d'Iran. Exp Parasitol. Rév. 2019;200:48–5

Article CAS PubMed Google Scholar

Suzuki T, Hori N, Miyake T, Hori Y, Mochizuki K. Kératite causée par un champignon rare, Malassezia restricta. Jpn J Ophthalmol. 2007;51(4):292–4.

Article CAS PubMed Google Scholar

Gupta N, Samantaray JC, Duggal S, Srivastava V, Dhull CS, Chaudhary U. Acanthamoeba kératite avec co-infection Curvularia. Indien J Med Microbiol. 2010;28(1):67–71.

Article CAS PubMed Google Scholar

Raghavan A, Nair AV, Venkatapathy N, Rammohan R. Voriconazole dans la gestion réussie d'un cas de kératite à Acanthamoeba-Cladosporium. Am J Ophthalmol Case Rep. 2021;22:101107.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley CS, Sicks LA, Pucker AD. Conservateurs ophtalmiques courants dans les produits d'entretien des lentilles de contact souples : avantages, complications et comparaison avec les solutions sans conservateur. Clin Optom. 2021;13:271–85.

Article Google Scholar

Alkharashi M, Lindsley K, Law HA, Sikder S. Interventions médicales pour la kératite à acanthamoeba. Cochrane Database Syst Rev. 2015. https://doi.org/10.1002/14651858.CD010792.pub2.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous reconnaissons avec gratitude la contribution de LVPEI, Hyderabad, Inde pour avoir fourni des souches d'Acanthamoeba et des données cliniques sur les patients AK. BR est récipiendaire de la bourse d'études sur les frais de scolarité (UNSW, Sydney) pour son doctorat, avec laquelle cette étude a été réalisée.

Le résumé préliminaire de cette étude a été présenté au Forum mondial des microbes, du 20 au 24 juin 2021 (virtuel) et à la réunion scientifique annuelle de l'Australian Society for Microbiology, du 31 mai au 3 juin 2021 (virtuel), sous forme d'affiche.

Aucun financement n'a été prévu pour cette étude.

École d'optométrie et des sciences de la vision, Faculté de médecine et de santé, UNSW, Sydney, Australie

Binod Rayamajhee, Mark Willcox, Gauri Shankar Shrestha & Nicole Carnt

Jhaveri Microbiology Centre, Prof. Brien Holden Eye Research Center, Hyderabad Eye Research Foundation, LV Prasad Eye Institute (LVPEI), Kallam Anji Reddy Campus, Hyderabad, Inde

Savitri Sharma

Institute of Biomedical and Environmental Health Research, School of Health and Life Sciences, University of the West of Scotland (UWS), Paisley, PA1 2BE, Écosse, Royaume-Uni

Fiona L. Henriquez

The Cornea Institute, LV Prasad Eye Institute, Banjara Hills, Hyderabad, Inde

Raksheeth Nathan Rajagopal & Bhupesh Bagga

École des sciences biologiques, Université Monash, Clayton, VIC, 3800, Australie

Dinesh Subedi

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Le manuscrit a été écrit grâce aux contributions de tous les auteurs ; conceptualisation et design de l'étude : NC, MW, FLH, BR, SS ; Collection de souches d'Acanthamoeba : SS ; extraction des données cliniques : SS, RN, BB ; analyse des données cliniques : GS, BR ; investigation en laboratoire et analyse des données : BR, DS, MW, FLH, NC ; rédaction : préparation du projet original : BR ; et révision et édition : MW, NC, FLH, GS, DS, SS, RNR ; supervision : NC, MW, FLH et SS. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Binod Rayamajhee.

Ce protocole d'étude a été examiné et approuvé par le comité d'examen institutionnel de LVPEI, Hyderabad (LEC-BHR-R-09–21-758). Un consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les participants. Cette étude a été menée conformément aux principes éthiques et aux directives énoncées dans la Déclaration d'Helsinki.

N'est pas applicable.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Souches d'Acanthamoeba de référence utilisées dans cette étude pour l'analyse phylogénétique. Tableau 2 : Identification du génotype et de l'espèce des isolats d'Acanthamoeba récupérés chez des patients AK. Carte 1 : Carte montrant les états des patients AK de différents états de l'Inde avec des codes d'échantillon et des génotypes identifiés d'Acanthamoeba chez les patients AK. La carte a été créée à l'aide d'ArcGIS (Esri GIS, Californie, États-Unis). Figure S1. Répartition mensuelle des cas de KA pendant la période d'étude. Figure S2. Alignement de séquence de la région DF3 de l'ADNr 18S d'Acanthamoeba à l'aide de ClustalW. Tableau S3. Présentation clinique globale des patients atteints de kératite infectés par Acanthamoeba spp. Figure S3. Arbre phylogénétique déduit de la séquence d'ADNr 18S (ITS1) des champignons ; L'arbre a été créé en utilisant l'approche de jonction de voisins avec le paramètre Kimura 2 basé sur 1000 valeurs de bootstrap répétées. Figure S4. Image sur gel d'agarose (1%) d'amplicons PCR de 13 isolats d'Acanthamoeba (ARNr 18S), le test PCR a été effectué en utilisant la paire d'amorces spécifiques au genre Acanthamoeba JDPFw et JDPRv qui a donné des amplicons d'environ 450 pb. Fig. S5 : Image sur gel d'agarose (1 %) d'amplicons PCR de 13 isolats d'Acanthamoeba ciblant des bactéries intracellulaires. L'ARNr 16S, la paire d'amorces 515Fw et 806Rv (V4, ARNr 16S) a été utilisée, ce qui a donné des amplicons d'environ 293 pb.

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Réimpressions et autorisations

Rayamajhee, B., Sharma, S., Willcox, M. et al. Évaluation des génotypes, des endosymbiontes et des caractéristiques cliniques d'Acanthamoeba guéri d'une infection oculaire. BMC Infect Dis 22, 757 (2022). https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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Reçu : 05 mai 2022

Accepté : 12 septembre 2022

Publié: 29 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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