Fonctions du mucus olfactif humain et âge

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 971 (2023) Citer cet article

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Les odeurs sont détectées par les neurones sensoriels olfactifs, qui sont recouverts de mucus olfactif. Malgré l'existence d'études sur le mucus olfactif, ses constituants, ses fonctions et sa variabilité interindividuelle restent mal connus. Ici, nous décrivons une étude humaine qui a combiné la collecte de mucus olfactif et des tests psychophysiques olfactifs. Nos analyses ont révélé que le mucus olfactif contient de fortes concentrations de solutés, tels que des protéines totales, des éléments inorganiques et des molécules pour le métabolisme xénobiotique. Les concentrations élevées se traduisent par une capacité à capter ou à métaboliser un répertoire spécifique d'odorants. Nous apportons la preuve que le métabolisme des odorants modifie notre odorat. Enfin, la quantité de mucus olfactif diminue de manière dépendante de l'âge. Une expérience de suivi a récapitulé l'importance de la quantité de mucus dans la détection sensible des odorants par leurs récepteurs. Ces résultats fournissent une image complète des processus moléculaires dans le mucus olfactif et proposent une cause potentielle de déclin olfactif.

Les informations sur les odorants sont utilisées pour détecter les dangers, sélectionner et goûter les aliments, et reconnaître ainsi que communiquer avec d'autres personnes. Une capacité olfactive réduite augmente le risque de danger personnel et est associée à une diminution de l'appétit, à des problèmes physiques et mentaux et, en fin de compte, à une qualité de vie (QOL) inférieure1,2. L'importance de l'olfaction a été encore soulignée par la pandémie de maladie à coronavirus 2019, car la maladie provoque fréquemment un dysfonctionnement olfactif3. La fonction olfactive décline généralement avec l'âge et avec le développement de troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer4. Les cas de déclin de l'olfaction lié à l'âge ont également augmenté dans notre société de plus en plus vieillissante. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement olfactif est nécessaire pour développer une stratégie de traitement efficace.

Les odorants inhalés atteignent la fente olfactive (OC) au sommet de la cavité nasale. Les neurones sensoriels olfactifs (OSN) dispersés dans le CO détectent les odeurs à l'aide d'environ 400 récepteurs olfactifs (RO) et transmettent les informations sur les odeurs aux zones cérébrales supérieures via le bulbe olfactif5. De plus, de nouvelles preuves suggèrent qu'un processus important se produit probablement avant que les substances odorantes ne soient reconnues par les RO. Le CO des mammifères est recouvert d'une fine couche de mucus olfactif sécrétée par les glandes de Bowman et les cellules sustentaculaires6. Le mucus olfactif contient divers composants, notamment des protéines de liaison aux odeurs (OBP), des enzymes métaboliques et des éléments bioinorganiques7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En raison de la capacité de ces composants à interagir avec les odorants, ils jouent un rôle important dans l'efficacité de l'olfaction chez l'homme en transportant les volatils vers les sites de liaison des odorants des RO ou par le métabolisme enzymatique des odorants en structures non toxiques et/ou avec une plus grande affinité pour OU. Un flux continu de mucus peut assurer un lavage efficace de la muqueuse et l'élimination régulière des odorants, ce qui constitue une étape critique dans la récupération de la sensibilité après une exposition aux odorants22. Les preuves directes des fonctions du mucus olfactif et de leur importance dans la perception sont rares en raison de la difficulté à prélever suffisamment de mucus olfactif pur pour les analyses. Certaines études ont obtenu du mucus olfactif sous forme de solution saline à partir d'une cavité nasale irriguée, provoquant une dilution et incluant des impuretés des régions environnantes7,8. Bien que d'autres aient directement collecté des échantillons de mucus olfactif pur de participants humains, ils n'ont rapporté que des informations limitées sur ses fonctions9,10,11,13,14.

Le déclin olfactif lié au vieillissement est répandu dans la population âgée de ≥ 65 ans, sans traitement établi. Ce déclin a été signalé dans plusieurs aspects des compétences olfactives, notamment la sensibilité, la discrimination, l'identification et la récupération après adaptation23,24,25,26. Certaines causes potentielles d'olfaction âgée ont été proposées27. La dégénérescence du neuroépithélium liée à l'âge, y compris les anomalies des cellules basales, a été observée de manière constante chez les modèles animaux ainsi que chez l'homme28,29,30,31,32. Cette dégénérescence entraîne une diminution du nombre d'OSN et provoque des modifications atrophiques du bulbe olfactif33,34. Une étude précédente a suggéré des changements liés à l'âge dans le niveau d'expression des OR35, bien qu'une autre étude ait indiqué qu'ils avaient un schéma d'expression stable au cours du vieillissement36. Les changements dans les régions supérieures du cerveau sont impliqués dans les déficits fonctionnels liés à l'âge37. Cependant, la contribution de ces changements au déclin olfactif reste incertaine. Nous avons mené une étude d'association entre le déclin lié à l'âge de la sensibilité olfactive et le protéome du mucus olfactif10. Bien que plusieurs protéines se soient avérées être associées à la sensibilité olfactive, aucune ne semble être impliquée directement dans la détection des odorants auxquels les personnes âgées ont une sensibilité réduite. Ainsi, la cause majeure des déficits olfactifs liés à l'âge reste indéterminée.

Cette étude a clarifié les fonctions du mucus olfactif humain et leurs changements en fonction de l'âge. Nous avons mené une étude combinant le prélèvement de mucus olfactif pur avec des tests olfactifs. Nous avons également mené des expériences de suivi in ​​vitro et in vivo pour expliquer les associations fonctionnelles observées.

Il y a un manque de description des propriétés et des fonctions de base du mucus olfactif pur chez l'homme. Nous avons recueilli le mucus olfactif directement auprès de 30 participants en bonne santé sans plaintes sensorielles âgés de 20 à 67 ans. Après l'instillation de lidocaïne topique, un tampon neurochirurgical a été placé dans le sillon olfactif entre le cornet moyen et la cloison nasale supérieure (OC, Fig. 1a) et entre le cornet inférieur et la cloison nasale inférieure (INM) sous visualisation directe à l'aide d'un endoscope. Après 5 min, le mucus olfactif absorbé par les coussinets a été collecté et soumis à des analyses ultérieures.

Propriétés fondamentales et variabilité individuelle du mucus olfactif. (a) Dessin schématique de la cavité nasale humaine montrant l'emplacement du mucus échantillonné dans cette étude. Des échantillons de mucus ont été prélevés dans la fente olfactive (OC) et le méat nasal inférieur (INM). (b) Distribution et valeur médiane (ligne horizontale rouge) de la quantité de mucus nasal recueillie auprès de 30 participants. Chaque point représente la quantité moyenne de mucus des narines gauche et droite d'un sujet. (c) Dépendance météorologique de la quantité de mucus INM recueillie. La quantité de mucus INM a été normalisée à la quantité de mucus OC. Les diagrammes à moustaches montrent la médiane, les premier et troisième quartiles et les limites supérieure et inférieure dans les groupes de temps pluvieux (n = 6) et de temps ensoleillé (n = 24). ( d ) Distribution de la concentration totale de protéines dans le mucus OC (n = 30), le mucus INM (n = 29) et la salive (n = 30). (e) Corrélation entre la quantité et la concentration de protéines dans le mucus OC (n = 30). (f – i) Distribution des concentrations de Mg, Fe, Cu et Zn dans le mucus OC (n = 29), le mucus INM (n = 29) et la salive (n = 30). L'ion Cu n'a pas été détecté dans la salive. ( j ) Enrichissement spécifique aux femmes en Zn dans le mucus OC. La concentration de Zn dans le mucus de 14 participants féminins et 15 participants masculins est tracée. ( k ) Concentration de glutathion total (tGSH), de glutathion oxydé (GSSG) et de glutathion réduit (rGSH) dans le mucus OC (n = 30). ( l ) Analyse dose-réponse de l'activation des cellules HEK293T exprimant OR2T11 contre 0, 1 mM ou 1 mM de tert-butylmercaptan (tBM) avec des concentrations croissantes de CuCl2 complétées dans le milieu de culture cellulaire. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SE à partir de trois expériences indépendantes. Les cellules transfectées sans OR2T11 ont également été dosées (simulacre). ( m ) Aucune association significative entre la concentration de Cu dans le mucus OC et le score de seuil olfactif n'a été trouvée (n = 28 participants). La corrélation de Spearman n'était pas non plus statistiquement significative (P > 0,05). La signification a été évaluée avec un test U de Mann-Whitney. *, P = 0,0255 ; **, P = 0,0043.

La quantité d'échantillons de mucus collectés différait considérablement entre les participants et ne suivait pas une distribution normale (P <0, 01, test de normalité de Shapiro – Wilk, Fig. 1b, tableau supplémentaire 1). Le poids des échantillons de mucus OC variait de 7 à 144 mg (médiane, 36,9 mg) par cavité nasale chez 30 participants, tandis que celui du mucus INM variait de 0 à 135 mg (médiane, 45,2 mg). Ces variations n'étaient pas causées par des problèmes techniques car les quantités de mucus OC collectées de chaque côté de la narine par des procédures indépendantes étaient corrélées (rho de Spearman = 0,50, P < 0,01) ; cette conclusion a également été étayée par l'association significative entre la quantité de mucus OC et INM obtenue de chaque sujet (rho de Spearman = 0,56, P <0,01, Fig. 1a supplémentaire), suggérant que la variabilité individuelle de la quantité de mucus collecté était causée par un ou des facteurs intrinsèques.

La variation individuelle des quantités de mucus INM était associée au(x) facteur(s) intrinsèque(s) et au facteur environnemental d'humidité le jour de l'échantillonnage. La quantité de mucus INM semblait être plus faible lorsqu'elle était collectée par temps ensoleillé (humidité relative, 42%) que par temps pluvieux (71–100%), suggérant une déshydratation du mucus INM (Fig. 1b supplémentaire). En revanche, la quantité de mucus OC recueillie ne différait pas selon les conditions météorologiques. La dépendance climatique du mucus INM était significative lorsqu'elle était analysée en tant que valeurs normalisées avec des quantités de mucus OC variables individuellement (Fig. 1c). Ainsi, le mucus INM est important pour humidifier l'air plus sec inhalé avant qu'il n'atteigne et ne déshydrate le mucus OC; sinon, les fonctions du mucus OC seront altérées, comme indiqué dans la muqueuse trachéobronchique38. Pendant ce temps, l'indépendance climatique suggère que la variation individuelle de la quantité de mucus OC est principalement attribuable à un ou plusieurs facteurs intrinsèques.

Il y a eu peu de description des propriétés de base du mucus OC, en particulier les concentrations de protéines totales et d'éléments inorganiques. Dans cette étude, nous avons d'abord déterminé la concentration en protéines totales des fluides corporels échantillonnés à l'aide d'un test d'acide bicinchoninique PierceTM (BCA) (Fig. 1d). Le mucus OC contenait des concentrations de protéines plus élevées que le mucus INM ou la salive. Notamment, la concentration en protéines du mucus OC variait également considérablement d'un individu à l'autre, allant de 6, 2 à 20, 8 mg / ml, et présentait une relation négative avec la quantité de mucus OC collectée (Fig. 1e).

Un métabolisme xénobiotique élevé nécessite une forte concentration d'enzymes et d'éléments inorganiques qui constituent leurs centres actifs. Les concentrations de quatre éléments bioinorganiques traces (Mg, Fe, Zn et Cu) ont été quantifiées avec succès à partir de tous les échantillons, à l'exception du Cu de la salive. Les concentrations de cinq autres éléments, Al, Cr, Mn, Ni et Co, étaient inférieures à la limite inférieure de quantification (100 ppb pour le mucus OC et INM et 5 ppb pour la salive). Dans l'ensemble, le mucus OC contenait des concentrations plus élevées d'éléments inorganiques que le mucus INM ou la salive, à l'exception du Zn (Fig. 1f – i). La concentration de Zn ne différait pas entre le mucus OC et INM et montrait un enrichissement spécifique aux femelles (Fig. 1j). En accord avec l'objectif du métabolisme xénobiotique et de la détoxification, nous avons détecté des concentrations individuellement variées d'un antioxydant de faible poids moléculaire, le glutathion39, dans le mucus OC (Fig. 1k). La concentration de glutathion était corrélée à la concentration de Fe (Fig. 1c supplémentaire). Des concentrations similaires de glutathion ont été détectées dans un mélange de quantités égales de mucus INM des participants : 163 μM de glutathion oxydé (GSSG) et 23 μM de glutathion réduit (rGSH). En revanche, la salive n'a montré aucun niveau détectable de glutathion.

La concentration élevée de Cu dans le mucus OC était remarquable même par rapport à celle du sérum (concentration moyenne: 4,8 ppm (75 μM) dans le mucus OC contre 1,1 ppm dans le sérum), mais similaire à celle du mucus OC de souris estimée par mesurer le liquide de lavage nasal (42 μM)15,40. Ce résultat semble être raisonnable compte tenu du fait que les OSN utilisent Cu pour la détection sensible des odorants soufrés15. La concentration de Cu dans le mucus OC variait de 12, 6 à 189 μM, similaire à la plage de concentration efficace pour améliorer la réactivité des cellules exprimant la RO à un composé soufré, le tert-butylmercaptan (tBM; Fig. 1l)41. Cependant, cette variable n'expliquait pas la variance individuelle de la sensibilité olfactive au tBM (Fig. 1m). Cette divergence suggère : (1) une limitation méthodologique pour discriminer les ions Cu liés aux protéines et les ions Cu libres ; et (2) la présence de facteurs plus dominants, tels que la variation génétique des RO détectant les odeurs de soufre, comme suggéré précédemment42.

Un aspect fonctionnel important du mucus OC a été proposé sur la base des fonctions des OBP. Il a été considéré que le but de leur capacité de liaison aux odorants est de solubiliser efficacement les odorants hydrophobes et de les délivrer aux OR9,22,43,44. Cependant, ceci est basé uniquement sur des analyses in vitro utilisant des OBP produits artificiellement ; par conséquent, on ne sait pas si le mucus OC lui-même a cette capacité et contribue à la perception olfactive des odorants liés.

Au moins deux OBP putatifs ont été exprimés dans le mucus olfactif humain, mais leur activité de liaison aux odeurs n'a pas été caractérisée. Dans cette étude, nous avons évalué l'activité de capture des odeurs du mucus OC. Avant d'étudier le mucus OC, nous avons utilisé Sus scrofa odorant-binding protein-1 (pigOBP), un OBP de mammifère bien caractérisé, pour établir l'expérience45,46. Tout d'abord, le pigOBP recombinant purifié a été soumis à un test de liaison compétitive bien établi en utilisant le ligand de fluorescence 1-aminoanthracène (1-AMA)44,45,46. Le résultat d'une étude précédente dans laquelle la fluorescence du complexe pigOBP et 1-AMA a été désactivée lors de la liaison d'un ligand connu, le citronellol, a été confirmé (Fig. 2a – c) 46 . En utilisant ce test de liaison, l'ambrettolide (Amb) et la l-menthone ont été identifiés comme de nouveaux ligands avec une affinité plus élevée pour le pigOBP (Fig. 2b, c). Comme le test de liaison compétitive nécessite une grande quantité de mucus OC pour tester plusieurs odorants, un type d'expérience différent a été utilisé. La solution de pigOBP a été préparée dans un flacon en verre et mélangée avec trois ligands (Fig. 2d). La quantité de ligands libérés de la solution de pigOBP dans l'espace de tête a été absorbée et mesurée à l'aide d'une microextraction en phase solide (SPME) suivie d'une chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC/MS). Les ligands ayant une affinité plus élevée pour le pigOBP dans le test de liaison compétitive ont montré une libération plus lente, entraînant des concentrations plus faibles dans l'espace de tête (Fig. 2e, f). La libération plus lente a été causée par la propriété de capture des odeurs de pigOBP, car elle a été bloquée par l'ajout du ligand compétitif 1-AMA (Fig. 2g). Ces données ont validé l'expérience pour évaluer l'activité de capture d'odeurs d'échantillons de mucus en fonction de la quantité d'odorants dans l'espace de tête.

Propriété de captation des odeurs du mucus olfactif. ( a ) Essai de liaison compétitive pour pigOBP aux odorants. Les données représentent la fluorescence du véhicule (Tris – HCl), 10 μM pigOBP, 1 μM 1-AMA et leur mélange. ( b ) Modification de la fluorescence lorsque le complexe pigOBP-1-AMA a été exposé à des concentrations croissantes d'odorants. La fluorescence a été normalisée en utilisant les valeurs du véhicule et du mélange de pigOBP et de 1-AMA. Barres d'erreur, écart type sur trois répétitions. (c) Structures chimiques des odorants. ( d ) Procédure expérimentale pour la quantification de la capacité de liaison des odorants basée sur les concentrations d'odorants dans l'espace de tête. (e, f) Capacité de capture des odeurs de pigOBP. Trois substances odorantes émises par la solution pigOBP ont été extraites et analysées avec SPME-GC/MS. ( e ) pigOBP a réduit la libération d'odorants d'une solution d'une manière dépendante de la dose et de l'affinité. ( f ) Propriétés de capture d'odorant de 30 μM pigOBP en fonction de la concentration d'odorant. ( g ) Ajout de la libération induite par 1-AMA d'odorants à partir de la solution pigOBP. Les données sont présentées sous forme de pourcentage de surface de pic, où la surface de pic détectée à partir de la solution odorante sans pigOBP a été définie sur 100 %. ( h ) Variance individuelle de la capacité de capture des odeurs du mucus OC. Concentration relative dans l'espace de tête des substances odorantes émises par × 10 de mucus OC dilué. Les odorants ont été ajoutés avec de l'éthanol pour une concentration finale de 500 uM. La surface de pic de chaque odorant sans mucus OC a été fixée à 100 % après normalisation avec la surface de pic d'éthanol. (i) Dépendance à la concentration en odorant de la capacité du mucus OC. Concentration relative dans l'espace de tête des substances odorantes émises par le mucus OC dilué × 10 (5 à 500 μM pour les concentrations finales). ( j ) Corrélation de la capacité de capture des odeurs et de la concentration en protéines du mucus OC (n = 28). ( k ) Association entre la capacité de capture des odeurs et la sensibilité perceptuelle à l'Amb. OBP, protéine de liaison odorante ; PEA, alcool phényléthylique.

Les propriétés de capture des odeurs d'un mélange de volumes égaux de mucus OC obtenu à partir de 30 participants ont été étudiées. Les trois substances odorantes suivantes ont été testées : (1) Amb, qui a la plus forte affinité pour pigOBP ; (2) muscone, un parfum important en raison de sa qualité olfactive supérieure ; et (3) l'alcool phényléthylique (PEA), l'odorant le plus couramment utilisé pour la recherche olfactive en raison de son faible effet trijumeau47. Les concentrations dans l'espace de tête des trois odorants étaient nettement plus faibles lorsqu'elles étaient mélangées avec le mucus OC qu'avec le mucus, la salive ou la solution saline INM, bien que nous n'ayons pas été en mesure de produire des répliques d'essai nécessaires à l'analyse statistique en raison de la quantité limitée d'échantillons collectés (Fig. 2). La capacité était toujours claire pour Amb et montrait une variabilité individuelle même lorsque le mucus OC était appliqué à une dilution de dix fois (Fig. 2h). Cette libération ralentie dépendait de la concentration d'Amb mélangée à du mucus OC, conformément aux caractéristiques observées de pigOBP (Fig. 2i). Nous pouvons exclure la possibilité que la plus faible concentration d'Amb dans l'espace de tête ait été causée par la décomposition dans le mucus OC. En effet, l'Amb restant dans le mucus OC était détectable lorsqu'il était extrait avec un solvant organique et analysé par GC/MS (81 % de l'Amb extraite de la solution saline). La propriété de capture d'Amb était positivement corrélée à la concentration de protéines dans le mucus OC (Fig. 2j).

Nous avons ensuite recherché si l'activité de capture d'odeurs du mucus OC était associée à la perception, et les résultats ont montré qu'elle n'était pas un déterminant pour la détection sensible d'Amb car aucune corrélation n'a été observée entre elles (Fig. 2k). Les deux participants dont le mucus OC manquait complètement d'activité de capture pour Amb ont montré un score de sensibilité perceptive moyen par rapport à 30 participants (7,5 et 3, entre 0 et 15 ; score moyen : 4,9). En résumé, cette étude fournit des preuves que le mucus OC humain présente une capacité de liaison aux odeurs significative non associée à la sensibilité olfactive.

Ensuite, nous décrivons la capacité métabolique du mucus OC humain et ses variations individuelles. Tout d'abord, six substances odorantes ont été sélectionnées pour nos expériences car elles auraient été métabolisées dans des échantillons liés au mucus OC (esters : acétate de p-crésyle [pCA] 1 et acétate de trans-2-hexényle 15 ; aldéhydes : benzaldéhyde 23 et octanal 25 ; cétones : 2′-méthoxyacétophénone 28 et acétophénone 30)7,20,48,49. Ces odorants ont été mélangés avec le mucus OC collecté (un mélange de quantités égales de tous les participants), et leurs extraits d'acétate d'éthyle ont été analysés par GC/MS. Les résultats ont montré que le mucus OC induisait les métabolismes suivants : hydrolyse des esters produisant du p-crésol 2 (99 % comme rapport d'abondance du pic du chromatogramme ionique total (TIC) du métabolite) et du trans-2-hexénol 16 (16 %) ; et réduction et oxydation des aldéhydes produisant de l'alcool benzylique 24 (51%), de l'octanol 26 (33%) et de l'acide octanoïque 27 (50%; Fig. 3a – d, Fig. 3a supplémentaire). Cependant, les métabolites dérivés des deux cétones, 2′-hydroxyacétophénone 29 et salicylate de méthyle 31, n'ont pas été détectés, même si l'expression génique des CYP, qui les oxydent, a été rapportée dans l'OC50.

Activité enzymatique du mucus olfactif. ( a – d ) Activité enzymatique présumée du mucus de la fente olfactive (CO) et détection des métabolites résultants. Les substances odorantes ont été incubées dans du mucus salin ou OC. Le réactif a été extrait à l'aide d'acétate d'éthyle et analysé par chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (GC/MS). L'intensité des pics d'ions totaux ou d'ions extraits a été normalisée à une surface de pic d'ester 19, qui n'a pas subi de conversion médiée par le mucus OC. Les barres grises et bleues représentent des intensités ioniques totales normalisées de 20 000 et 2 000, respectivement. La barre jaune représente une intensité d'ions extraits de 50. (e) Comparaison de l'activité enzymatique du mucus OC avec le mucus et la salive du méat nasal inférieur (INM). Les quantités de produit dans chaque conversion enzymatique sont présentées sous forme de valeurs normalisées, où une surface de pic de métabolite dans le mucus OC est fixée à 100 %. ( f ) Différence individuelle d'activité enzymatique du mucus OC et son association avec la concentration de protéines. L'activité estérase du mucus individuel × 10 OC a été évaluée sur la base d'un taux de conversion comme [p-crésol (mol)]/([pCA (mol)] + [p-crésol (mol)]) 5 min après l'acétate de p-crésyle ( pCA) a été appliqué sur le mucus OC (n = 29). ( g ) Association entre l'activité estérase et la concentration de carboxylestérase 1 (CES-1) dans le mucus OC (n = 29). Les lignes vertes et magenta indiquent les valeurs moyennes de mucus INM et OC, respectivement. ( h ) Sélectivité du substrat du mucus OC et CES-1. Le CES-1 recombinant n'a pas montré de réactivité identique avec le mucus OC. Le mucus OC a montré une activité résiduelle sous les inhibiteurs de CES (phosphate de bis (4-nitrophényl)), qui a complètement inhibé CES-1. La variabilité inter-échantillons de la surface de pic détectée a été corrigée à l'aide de la surface de pic de l'ester 19 non métabolisé. (i) Évolution dans le temps du taux de conversion de pCA en p-crésol dans × 10 mucus OC dilué ou solution CES-1. La réaction s'est déroulée linéairement jusqu'à 5 min après l'ajout de pCA dans le mucus OC dilué dix fois et jusqu'à 40 min dans la solution CES-1. ( j ) Courbe de Michaelis – Menten du métabolisme de la pCA dans du mucus OC dilué × 10 ou une solution CES-1. Différentes concentrations de pCA ont été ajoutées et le taux de conversion a été mesuré à chaque fois. ND, non détecté.

La remarquable capacité du mucus OC pour l'hydrolyse des esters nous a conduit à étudier la relation structure-activité. Une expérience supplémentaire a été menée pour tester une série d'odorants d'ester, avec pCA comme contrôle positif (97 % en tant que rapport d'abondance du pic TIC du métabolite). Les résultats ont démontré que le mucus OC a converti des esters phénoliques (acétate de 2-phényléthyle 3 [43 %], acétate d'anisyle 5 [8 %], acétate de cinnamyle 7 [16 %]), un ester cycloaliphatique (acétate de l-menthyle 9 [14 % ]) et des esters aliphatiques (acétate de cis-3-hexényle 11 [19 %], acétate de citronellyle 13 [25 %] ; Fig. 3a). En revanche, les esters stériquement encombrés (acétate de linalyle 17, acétate de terpinyle 19 et acétate d'isobornyle 21) n'ont pas été convertis. Le métabolisme observé a été induit plus en évidence par le mucus OC que par le mucus INM ou la salive, ce qui est cohérent avec les concentrations de soluté plus élevées dans le mucus OC (Fig. 3e, Fig. 3b supplémentaire).

Ensuite, la variabilité individuelle de l'activité estérase du mucus OC a été analysée en se concentrant sur la conversion de pCA en p-crésol. La comparaison a été effectuée sur la base d'un taux de conversion de 5 min, car la réaction s'est déroulée de manière linéaire jusqu'à 5 min après l'ajout de pCA (voir Fig. 3i). Un participant a été exclu de cette analyse car la quantité de mucus collecté était insuffisante. Les taux de conversion (rapport molaire) différaient considérablement entre les participants et variaient de 5 à 45 %, avec une valeur moyenne de 18 %. L'activité estérase était négativement corrélée à la quantité de mucus OC et positivement corrélée aux concentrations de divers composants, tels que les protéines totales (Fig. 3f, Tableau supplémentaire 1).

Les molécules provoquant une activité estérasique élevée dans le mucus OC ont également été étudiées. CES-1 a été présumé contribuer à cette réaction dans une étude précédente utilisant des rongeurs7. Un dosage immuno-enzymatique (ELISA) a montré que la concentration de CES-1 était plus élevée dans le mucus OC que dans le mucus INM ou la salive (concentration moyenne : 5,73 μg/mL, 1,24 μg/mL et 0,06 μg/mL, respectivement, Fig. 3g). Cependant, CES-1 ne tenait pas pleinement compte de l'activité estérase dans le mucus OC. La concentration de CES-1 dans le mucus OC représentait moins de variance individuelle dans l'activité estérase que la concentration de protéines totales (44% contre 53%, Fig. 3f, g). De plus, le mucus OC a montré des sélectivités de substrat différentes de celles de la solution CES-1 recombinante. Le CES-1 recombinant n'a pas reconstitué la réactivité du mucus OC à l'acétate d'anisyle 5 et à l'acétate de citronellyle 13 (Fig. 3h). De plus, le mucus OC a montré une activité résiduelle sous les inhibiteurs de CES benzil et bis (4-nitrophényl) phosphate (BNPP), qui ont complètement inhibé les réactions médiées par une concentration égale de CES-1 recombinant (Fig. 3h, Fig. 3c supplémentaire). Enfin, une solution avec une concentration équivalente de CES-1 recombinant a montré moins de réactivité que le mucus OC lors de l'analyse de la cinétique enzymatique (Fig. 3i, j). Ces résultats ont indiqué la présence d'une ou plusieurs autres enzymes responsables de l'activité enzymatique.

Une étude précédente a rapporté qu'un faible taux de conversion enzymatique d'un odorant dans la salive humaine affectait légèrement la perception des odeurs8. Nous avons émis l'hypothèse que l'activité estérasique drastique du mucus OC avait un effet plus important sur la perception des odeurs du substrat. Nous avons mené une étude sensorielle en utilisant un paradigme d'adaptation olfactive basé sur l'étude précédente8. L'adaptation olfactive est un phénomène largement connu de réduction de la sensibilité spécifique à l'odorant après une exposition prolongée à un odorant identique (Fig. 4a, b)51. En conséquence, dans la présente étude, la sensibilité olfactive au p-crésol a diminué après une pré-exposition au p-crésol, alors qu'elle n'a pas été induite par une odeur prolongée de muscone (Fig. 4c, d). En revanche, la pré-exposition de pCA a induit une réduction significative de l'intensité perceptuelle de son métabolite p-crésol, suggérant que pCA est converti en p-crésol dans le mucus OC. Une autre explication de ce résultat est que l'odeur de pCA induit une désensibilisation de l'OR, qui joue un rôle majeur dans la reconnaissance du p-crésol. Cependant, les résultats de nos tests in vitro ont exclu cette possibilité. Parmi les 378 OR humains testés exprimés dans les cellules HEK293T, OR9Q2 s'est avéré être le récepteur le plus sensible au p-crésol (Fig. 4e, Fig. 4 supplémentaire). La caractérisation fonctionnelle ultérieure a montré que OR9Q2 n'était pas sensible à pCA (Fig. 4f, g). Ainsi, la raison pour laquelle l'adaptation avec le pCA est parallèle à une adaptation exceptionnelle avec le p-crésol est que la conversion du pCA en p-crésol se produit dans la cavité nasale. Cependant, on ne sait toujours pas si les humains perçoivent un mélange de pCA métabolisant et de génération de p-crésol dans un reniflement de pCA, en raison d'un manque d'informations sur la cinétique de réaction in vivo.

Effet de la conversion enzymatique sur la perception. ( a, b ) Un modèle montrant l'adaptation olfactive pour le p-crésol ou l'acétate de p-crésyle (pCA) par l'activation et la désensibilisation d'un sous-ensemble distinct de récepteurs olfactifs (OR). (c) Le schéma expérimental d'adaptation et l'évaluation sensorielle. Chaque sujet a évalué l'intensité perçue de la première bouteille et de la troisième bouteille, qui contiennent toutes deux des boules de coton saturées de p-crésol. La deuxième bouteille contenait un stimulus adaptatif : eau distillée (sans odeur), p-crésol, muscone ou pCA. Les participants ont été invités à sentir le p-crésol et à enregistrer leur intensité perçue de l'odeur sur une échelle de 95 mm, allant de l'absence d'odeur à l'odeur forte. (d) Modification de l'intensité perçue du p-crésol après une exposition prolongée avec chaque échantillon de test (n = 8). Des changements statistiquement significatifs par rapport à un témoin (pas d'odeur) ont été déterminés par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec un écart type inégal et le test de comparaisons multiples de Holm-Sidak. *, P = 0,0303 ; **, P = 0,0012. (e) Dépistage des RO humains pour le p-crésol. Chacun des 378 OR répertoriés le long de l'axe des x a été exprimé dans des cellules HEK293T et stimulé avec du p-crésol (1 mM). Les activations OR ont été surveillées à l'aide d'un test de gène rapporteur de la luciférase régulé par la CRE. L'axe y indique le facteur d'augmentation de l'activité OR où un signal provenant de cellules stimulées est divisé par celui provenant de cellules non stimulées exprimant le même OR (valeurs moyennes de deux répétitions de dépistage). (f, g) Imagerie calcique de l'activation de OR9Q2. ( f ) Une trace de réponse représentative des cellules réactives. Les lignes verticales violettes autour de la trace représentent l'écart type à partir de 50 cellules. Les lignes horizontales au-dessus de la trace indiquent la durée des stimulations avec 1 mM de pCA et 0,3 mM de p-crésol. ( g ) Proportion de cellules répondant à 0, 3 mM ou 1, 0 mM de chaque odorant de trois expériences indépendantes (moyenne ± SE). ( h ) Courbe dose-réponse de l'activité potentielle du récepteur transitoire de la mélastatine 8 (TRPM8) avec le l-menthol et l'acétate de l-menthyle. La fluorescence dépendante de l'influx d'ions calcium dans TRPM8 exprimée de manière stable dans les cellules HEK293T a été mesurée. L'intensité de fluorescence a été normalisée avec 4 μM d'ionomycine. Les données proviennent de trois expériences indépendantes (moyenne ± SE).

Un reniflement chez l'homme dure 1 à 2 s. Nous avons examiné si la cinétique de la réaction de conversion enzymatique était suffisamment rapide pour influencer la perception au sein d'un reniflement. Étant donné qu'il est difficile d'évaluer la génération d'une qualité d'odeur spécifique dérivée uniquement d'un produit mélangé à un substrat, une perception somatosensorielle familière, c'est-à-dire le refroidissement, a été utilisée comme indice plus clair. L'inhalation de l-menthol 10 ou de son acétate, le l-menthyl acétate 9, provoque une sensation de refroidissement, qui est clairement évaluable52. La sensation de refroidissement est très probablement causée par l'activation du potentiel de récepteur transitoire de la mélastatine 8 (TRPM8) dans les neurones somatosensoriels53. Contrairement au l-menthol 10, l'acétate de l-menthyle 9 n'a montré aucune activité TRPM8 (Fig. 4h). Cette divergence présente des preuves de la présence d'une activité de mucus OC in vivo qui métabolise l'acétate de l-menthyle 9 pour produire du l-menthol 10, comme démontré à l'aide d'un échantillon de mucus OC (Fig. 3a). Plus important encore, ce résultat démontre que la réaction de conversion enzymatique est suffisamment rapide pour affecter la perception des odeurs dans un reniflement. Ainsi, notre instantané perceptif de la nature chimique à l'extérieur du nez est modifié par le mucus olfactif avant que nous ne le percevions.

La sensibilité olfactive diminue généralement avec l'âge. Comme nous avons testé des participants plus jeunes (tranche d'âge : 20 à 67 ans) que ceux des études précédentes qui montraient un déclin significatif lié à l'âge24,26, une relation négative entre l'âge et la sensibilité olfactive à deux odorants (PEA et tBM) n'a pas été détectée ( Fig. 5 supplémentaire). En revanche, l'étude actuelle a révélé une réduction dépendante de l'âge de la sensibilité perceptive à l'Amb (rho = -0,45, P <0,05, Fig. 5a). Ce résultat indique que nos échantillons de mucus OC ont été prélevés auprès d'un groupe de participants présentant un déclin de l'olfaction lié à l'âge. Par conséquent, il a été possible d'identifier un facteur candidat à partir des échantillons de mucus OC qui présentait des changements liés à l'âge et une sensibilité olfactive réduite.

Relation entre la baisse de l'olfaction et la modification du mucus de la fente olfactive avec l'âge. (a–f) Facteurs associés à l'âge. L'axe des x indique l'âge des participants et l'axe des y représente les valeurs seuils olfactives pour l'ambrettolide (Amb ; a, n = 28), la quantité de mucus de la fente olfactive (OC) (b, n = 30), la quantité de mucus du méat nasal (INM) (c, n = 30), concentration en protéines dans le mucus OC (d, n = 30), taux de conversion de l'acétate de p-crésyle (pCA) en p-crésol dans × 10 de mucus OC dilué (e , n = 29), et la concentration relative de l'espace de tête d'Amb émise par le mucus OC (f, n = 28). ( g ) Résumé graphique des changements liés à l'âge dans le mucus olfactif. Le mucus OC a diminué en quantité et augmenté en concentration de composants avec le vieillissement. ( h ) Procédure expérimentale pour tester l'activation des cellules exprimant le récepteur olfactif (OR) recouvertes de différentes quantités de milieu (0 à 50 μL), qui imitent la diminution dépendante de l'âge de la quantité de mucus OC. Des boules de coton saturées d'odorants (100 μM) ont été placées au-dessus des cellules dans chaque puits de plaque. (i, j) Réponse des cellules exprimant cOR5A2 ou OR9Q2 contre Amb ou p-crésol diffusant à partir de la phase vapeur. La réponse a été normalisée avec la réponse maximale dans la condition de 50 μL. Chaque ligne montre la réponse moyenne de trois expériences indépendantes. Les nuances verticales représentent les erreurs standard.

Divers facteurs liés à l'âge ont été proposés comme pouvant entraîner une baisse de la sensibilité olfactive10,27,28,29,30,31,33,34,35,37. Cependant, il n'y a toujours pas d'exemples d'explications mécaniques reliant les changements de ces facteurs candidats à une diminution de la sensibilité olfactive. Cette étude a révélé de nouveaux changements liés à l'âge. La variabilité individuelle susmentionnée de la quantité de mucus OC était significativement corrélée à l'âge (rho = 0, 66, P <0, 001, Fig. 5b). Les participants âgés ont montré une quantité de mucus OC inférieure de 60 % à celle des participants plus jeunes (moyenne : 59,1 ± 21,0 mg chez les participants âgés de 20 s contre 23,5 ± 10,6 mg chez les participants âgés de 60 s). Le mucus INM a également diminué de manière dépendante de l'âge (rho = - 0, 35, P = 0, 056) et, par conséquent, ne fonctionnait plus suffisamment pour humidifier le mucus OC (Fig. 5c). En revanche, la concentration en protéines et l'activité enzymatique ont augmenté, indiquant que les quantités réduites de mucus OC étaient causées par une diminution de la teneur en eau (Fig. 5d, e). Malgré l'augmentation liée au vieillissement des concentrations de protéines totales dans le mucus OC, l'activité de capture de l'Amb n'a pas été améliorée (Fig. 5f), probablement en raison d'une diminution spécifique des OBP putatifs et/ou de l'existence d'autres facteurs inconnus. ) associé à l'activité10.

L'augmentation des concentrations de soluté et de l'activité enzymatique avec le vieillissement peut expliquer l'altération des capacités d'identification des odeurs contre une gamme restreinte d'odorants tels que le soufre et les esters ; cependant, cela n'explique pas l'altération de la sensibilité olfactive contre Amb (Fig. 5a) et d'autres odorants généraux. Au lieu de cela, une diminution de la quantité de mucus OC explique plus probablement la diminution de la sensibilité olfactive aux odorants généraux en raison des dommages médiés par la déshydratation de la bicouche lipidique des OSN et de la distorsion des structures OR. Ceci est cohérent avec les études précédentes. Une étude a démontré qu'une quantité réduite de mucus olfactif chez la souris diminuait la sensibilité olfactive54. Une autre étude a rapporté que l'augmentation de la quantité de mucus des lapins nouveau-nés entraînait une sensibilité olfactive élevée16.

L'étude actuelle a reconstitué l'effet d'une diminution de la quantité de mucus OC sur l'activation de la RO en réponse aux odorants (Fig. 5g, h). Contrairement à un grand nombre d'études précédentes dans lesquelles les odorants étaient stimulés en phase liquide8,15,19,41, les cellules HEK293T exprimant chaque OR ont été présentées avec un odorant en phase vapeur, nous permettant d'évaluer l'activation de l'OR dans des conditions plus pratiques. . Une boule de coton saturée d'une solution odorante a été placée au-dessus des cellules dans chaque puits d'une plaque à 96 puits (Fig. 5h). Les odeurs volatilisées à partir de la boule de coton ont atteint les cellules exprimant la RO à travers le milieu, et leurs réponses ont été surveillées à l'aide de GloSensor™ en temps réel. Une stimulation en phase vapeur a été observée comme indiqué par la découverte qu'aucune réponse n'a été observée lorsqu'un stimulant cellulaire non volatil (c'est-à-dire la forskoline) a été testé. Les activations d'une version consensus de OR5A2 (ci-après, cOR5A2) et OR9Q2 contre la phase vapeur d'Amb et de p-crésol ont été surveillées55. Le résultat a montré qu'un faible volume de milieu recouvrant les cellules exprimant l'OR provoquait une réponse maximale plus faible ; une réduction de 60% de la quantité de milieu (de 50 à 20 μL) a diminué l'amplitude de réponse de cOR5A2 et OR9Q2 à 33% et 35%, respectivement (Fig. 5i, j). Cette expérience n'a pas reconstitué les propriétés physiques et biochimiques du mucus OC. La toxicité considérable du mucus OC pour les cellules HEK293T a entravé l'expérience dans des conditions plus physiologiques. Par conséquent, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que des différences dans les quantités de mucus OC aient entraîné des effets différentiels sur l'activation de la RO. Néanmoins, il s'agit de la première étude à proposer un facteur causal du déclin de la sensibilité olfactive lié à l'âge avec une explication mécaniste potentielle.

La présente étude décrit en détail les caractéristiques du mucus OC humain. Le mucus OC contient des concentrations plus élevées de solutés, y compris les protéines totales, les éléments inorganiques et le glutathion, que les autres fluides corporels. Nos analyses fonctionnelles fournissent des conclusions concernant les fonctions précédemment suggérées du mucus OC et sa contribution à la perception des odeurs. Le mucus OC présente une remarquable capacité de capture d'odorant, mais cela n'explique pas la sensibilité perceptuelle à un odorant. De plus, l'étude actuelle a révélé que le métabolisme des odorants dans le mucus OC est impliqué dans la perception. Enfin, les présents résultats démontrent une diminution liée à l'âge de la quantité de mucus OC en tant que cause potentielle du déclin lié à l'âge de la sensibilité olfactive.

Cette étude a révélé les concentrations de solutés dans le mucus OC et leur variabilité individuelle. Nos résultats fournissent des informations essentielles qui expliquent les implications antérieures des fonctions du mucus OC, telles que la capacité de liaison des odeurs, le métabolisme xénobiotique élevé et la reconnaissance des odeurs médiée par le Cu9,41,43. De plus, les données actuelles, ainsi que la composition protéique rapportée précédemment, permettent la reconstitution du mucus OC et aident à étudier la signification fonctionnelle des propriétés émergentes, y compris le Zn en tant qu'élément de bloc d et en tant que caractéristique spécifique au sexe56,57. Les fonctions supposées du mucus OC ne se limitent pas à l'olfaction et incluent la protection des OSN contre les composés nocifs et la prévention des infections. Les données brutes divulguées fourniront une base pour de futures études visant à comprendre les fonctions du mucus olfactif sous plusieurs angles (tableau supplémentaire 1).

La fonction la plus largement supposée du mucus OC est le transport et la concentration des odorants via les OBP. En effet, une étude récente a testé la fonction potentielle d'un OBP humain dans la reconnaissance des odeurs par les RO ; cependant, ils ont testé un OBP produit artificiellement sans aucun ligand. Par conséquent, la question de savoir si le mucus OC a la capacité de capturer les odorants et de favoriser leur détection est restée sans réponse. Nos expériences in vitro et in vivo ont conclu que le mucus OC avait une capacité drastique de liaison aux odeurs ; cependant, ils n'ont pas expliqué la variance individuelle de la sensibilité olfactive. Ceci est cohérent avec les résultats d'un modèle d'insecte qui peut répondre aux odorants avec une sensibilité comparable lorsque tous les gènes OBP sont supprimés58. Nous supposons que l'activité de capture des odorants du mucus OC peut contribuer à l'élimination rapide des odorants du microenvironnement des OSN pour assurer la récupération d'une adaptation prolongée et prévenir les dommages causés par l'accumulation de substances nocives59.

Cette étude a révélé divers métabolismes xénobiotiques élevés du mucus OC avec une analyse cinétique. Deux études récentes ont rapporté les activités enzymatiques d'échantillons dérivés de mucus OC humain contre certains odorants8,14 ; cependant, ces études ont évalué les échantillons dans des conditions artificielles. Une étude a obtenu du mucus OC sous forme de solution saline à partir d'une cavité nasale irriguée, ce qui a probablement provoqué la dilution et l'inclusion d'impuretés des régions environnantes, telles que le mucus du méat nasal inférieur (INM)8. En effet, cette étude n'a pas détecté d'activité enzymatique relativement plus élevée du mucus OC. Une autre étude a directement recueilli le mucus OC, mais la réduction des aldéhydes n'a été détectée que dans le mucus OC dilué additionné de co-enzymes14. L'étude actuelle a testé le mucus OC sans dilution ni traitement et a étudié son activité contre une gamme plus large d'odorants. Notamment, les différences individuelles d'activité enzymatique ont été déterminées sur la base de la cinétique de réaction, fournissant des informations plus précises qu'une comparaison précédemment rapportée basée sur des mesures de point final8,14. Nos résultats ont démontré que le mucus OC intact a une capacité exceptionnelle de conversion odorante. Nous notons que la plus faible capacité du mucus INM par unité de masse que le mucus OC joue probablement une contribution significative à la perception étant donné que le mucus INM offre une surface plus large pour la conversion enzymatique des odorants inhalés. Cette clarification de la capacité peut permettre la conception d'un pro-odorant, qui n'active un RO qu'après avoir atteint un niveau suffisant de conversion enzymatique.

La découverte la plus importante de cette étude était une diminution liée à l'âge de la quantité de mucus OC. Conformément à nos observations, des études antérieures ont montré que le vieillissement induit des anomalies dans l'homéostasie de l'eau et se traduit par un mucus plus mince, avec une fonction détériorée dans d'autres tissus60,61,62. Une dégénérescence liée à l'âge des glandes de Bowman et de la sécrétion de mucus a été observée dans la cavité nasale28. La diminution de la teneur en eau et l'augmentation des concentrations de solutés provoquent probablement non seulement un dysfonctionnement des OSN médié par la sécheresse, mais conduisent également à une augmentation de la viscosité de la couche de mucus. Cela diminue la vitesse de diffusion des odorants absorbés et aggrave par conséquent l'efficacité de détection des molécules odorantes par les OSN. Une augmentation de la concentration de mucus (c'est-à-dire la déshydratation) est connue pour diminuer la vitesse d'écoulement du mucus et éliminer les substances, y compris les odorants63,64. L'élimination plus lente et la diminution du volume de mucus peuvent augmenter de manière synergique l'accumulation de substances volatiles nocives et de micro-organismes infectieux, ce qui altère le neuroépithélium et les glandes de Bowman, entraînant une accélération de la sénescence. Les preuves actuelles suggèrent que la récupération de l'eau dans le mucus OC peut être un traitement efficace pour le dysfonctionnement olfactif, une cause d'altération de la qualité de vie chez les personnes âgées.

Les participants ont été recrutés par échantillonnage en boule de neige et ont été rémunérés. Trente adultes japonais âgés de 20 à 60 ans ont participé à l'étude. Les participants n'avaient aucune preuve subjective ou objective d'inflammation naso-sinusienne sur la base de leurs antécédents ou de l'endoscopie nasale. Les femmes enceintes ont été exclues. Le protocole d'étude a été approuvé par les comités d'examen éthique de Kao Corporation et de l'hôpital Edogawa (numéro d'approbation : T141-180620) et a été mené conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki. Tous les participants ont donné leur consentement éclairé.

Les seuils olfactifs de trois composés (PEA, Amb et tBM) ont été mesurés. Les sources d'achat des odorants sont indiquées dans le tableau supplémentaire 2. Les seuils sensoriels ont été collectés à l'aide d'odorants dilués avec de l'huile minérale inodore (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en utilisant une procédure de choix forcé à trois alternatives. Les concentrations les plus élevées de solutions odorantes étaient les suivantes : PEA à 1000 ppm ; Amb à 10 000 ppm ; et tBM à 1 ppm. Ils ont été dilués deux fois 15 fois pour préparer 16 dilutions de chaque odorant. Dans chaque essai, les participants ont reçu trois ensembles de bouteilles dans un ordre aléatoire : un ensemble contenait le stimulus odorant et les autres ne contenaient que le diluant (blancs). Après avoir reniflé chaque ensemble séquentiellement, les participants ont été invités à identifier la bouteille contenant l'odeur. Aucune reconnaissance ou identification de qualité n'était requise. Pour chaque détection incorrecte, la concentration suivante la plus basse était présentée. Le premier essai a commencé avec la concentration la plus faible, et pour deux détections correctes consécutives, une concentration quatre fois plus élevée a été présentée dans le deuxième essai. Pour deux détections correctes consécutives dans le deuxième essai, la concentration suivante la plus élevée a été donnée jusqu'à ce que l'odorant soit correctement identifié. Lorsque la première concentration d'odorant n'a pas été identifiée dans le deuxième essai, la concentration suivante la plus faible a été présentée. Les concentrations moyennes des première et dernière détections correctes ont été identifiées comme le score seuil. Les concentrations ont été présentées sous forme de temps de dilution des solutions (15–0). La détection de la concentration la plus faible a été notée 15 et la détection erronée de la concentration la plus élevée a été notée 0. Il y a eu une erreur dans le protocole lors des tests de seuil pour deux participants, et leurs scores de seuil ont été exclus.

La salive entière a été recueillie directement dans un tube en plastique après rinçage de la bouche avec de l'eau. L'échantillon a été centrifugé (10 000 tr/min pendant 10 min) et congelé à - 80 ℃ jusqu'à utilisation. La salive entière a été collectée le même jour que le test de seuil d'odeur, et le mucus olfactif a été collecté 1 à 3 semaines plus tard à l'hôpital d'Edogawa. Des échantillons de mucus ont été prélevés à l'aide de coussinets neurochirurgicaux (BEMSHEETS XR, 0,7 × 0,7 cm; KAWAMOTO Corporation, Osaka, Japon). Le tampon pouvait absorber un maximum d'environ 150 mg d'eau, et la quantité de tout le mucus collecté était inférieure à 150 mg. Les coussinets ont ensuite été placés dans un tube avec un trou au fond fait par une aiguille de calibre 20. Un autre tube a été placé sous le tube perforé et centrifugé (10 000 tr/min pendant 10 min). Les sécrétions nasales recueillies ont été congelées à - 80 ℃ jusqu'à leur utilisation. Chez un sujet, aucun mucus INM n'a été prélevé dans les cavités nasales gauche ou droite. Chez un sujet, le tampon placé sur l'INM gauche est tombé dans la bouche pendant le prélèvement. Seul le mucus INM prélevé dans la cavité nasale droite a été utilisé pour toutes les analyses. Le mucus olfactif a été prélevé pendant 5 jours (6 participants/jour). Pendant ce temps, le temps était ensoleillé un jour et pluvieux les autres jours.

Les concentrations de protéines ont été déterminées en utilisant le test de protéines BCA avec BSA comme standard. Les concentrations de CES-1 ont été déterminées à l'aide d'un kit ELISA CES-1 (RayBiotech; Peachtree Corners, GA, USA). Les concentrations de glutathion ont été déterminées à l'aide d'un kit de quantification GSSG/GSH (DOJINDO, Kumamoto, Japon). Des quantités égales de mucus prélevées des côtés gauche et droit ont été mélangées et analysées à l'exception d'un échantillon de mucus INM, comme décrit précédemment.

N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP ; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japon ; pour l'industrie électronique) et acide nitrique 1,38 (60 % ; Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japon ; pour l'électronique l'industrie) ont été utilisés pour préparer la solution de la courbe d'étalonnage et la dilution de l'échantillon. SPEX CertiPrep (solution étalon mixte élémentaire XSTC-13, 10 μg/mL, 5 % HNO3 ; SPEX, Metuchen, NJ, États-Unis) a été utilisée comme solution étalon pour la courbe d'étalonnage. Un mélange de 5 μL de mucus OC et de mucus INM (mélange gauche et droit) ou 100 μL de surnageant de salive a été dissous dans 5 mL de NMP contenant de l'acide nitrique à 1 %. Des mesures automatiques ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) iCAP Qs de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, États-Unis) connecté à l'échantillonneur de mesure automatique ESI SC2 DX et contrôlé par le logiciel Qtegra. Un échantillon dilué avec 1% de NMP contenant de l'acide nitrique a été directement introduit dans une chambre cyclonique en quartz réglée à 4°C par auto-aspiration. De l'oxygène a été introduit dans le plasma pour empêcher l'accumulation de carbone. Les conditions de collision du gaz hélium ont été appliquées pour la mesure du Zn. Des conditions de réaction de collision de plasma froid et de gaz NH3-He à 1% ont été appliquées à tous les éléments sauf Zn (tableau supplémentaire 3).

La courbe d'étalonnage a été préparée avec une solution de NMP additionnée d'acide nitrique à 1 % à des concentrations de 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 50 et 100 ng/mL. La linéarité (r > 0,999) a été obtenue pour tous les éléments, et la limite inférieure de quantification de l'échantillon injecté a été confirmée à 0,1 ng/g (100 ppb pour le mucus OC et INM, 5 ppb pour la salive). Les échantillons étaient trop concentrés pour déterminer les concentrations de Na, K et Ca ; ainsi, des courbes standard ont été préparées dans la plage de 0,1 ppb à 100 ppb pour Mg et de 0,1 à 10 ppb pour les autres. Des échantillons vierges ont été préparés en trempant des tampons neurochirurgicaux dans de l'eau Milli-Q, puis en recueillant l'eau sous forme de mucus olfactif. Les concentrations de Mg, Fe, Cu et Zn dans les échantillons de mucus ou de salive étaient plus élevées que celles des échantillons vierges. La concentration en Fe d'un échantillon de mucus OC était plus élevée que celle des autres (~ 40 ppm, alors que la moyenne des autres était de 1,67 ppm). Cet échantillon pouvait contenir une petite quantité de sang; ainsi, les données ICP-MS de cet échantillon ont été exclues des analyses.

L'ADN codant pour pigOBP a été synthétisé à l'aide des services de synthèse de gènes GenScript (GenScript Biotech Corp., Piscataway, NJ, USA). Le gène synthétisé est fondamentalement la même séquence que NM_213796.1 ; cependant, il code des protéines portant la mutation F88W46 et l'étiquette His6 à l'extrémité C-terminale mais sans la séquence de 15 acides aminés qui code une séquence de peptide signal à l'extrémité N-terminale. Le gène synthétisé a été digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et Xhol et cloné dans pET-22b (Merck Biosciences, Madison, WI, USA). Cela a abouti au vecteur d'expression final codant pour pigOBP avec une séquence de tête pelB N-terminale. pigOBP a été exprimé et purifié par GenScript en utilisant la souche Escherichia coli BL21 (DE3) et une colonne Ni. La concentration a été déterminée en utilisant le dosage des protéines de Bradford avec de la BSA comme étalon. pigOBP a été détecté à l'aide d'AcM anti-His de souris (GenScript) dans une analyse Western blot.

Les mesures ont été effectuées comme décrit précédemment46. Des solutions odorantes (Amb, l-menthone et citronellol) ont été préparées sous forme de solutions mères à 100 mM dans EtOH. 1-AMA (Accu Standard Inc., New Haven, CT, USA) a été préparé sous forme de solution mère 1 mM dans EtOH. pigOBP a été préparé sous forme de solution mère 60 μM dans une solution saline tamponnée au phosphate. Les solutions mères ont été congelées puis diluées avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) pour les dosages. Nous avons ajouté 50 µL de la solution testée à une plaque noire à 96 puits (Corning Inc., Corning, NY, USA). L'émission de fluorescence des solutions a été enregistrée sur un lecteur de plaque multimode EnSight (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

La solution de mélange odorant (40 μL) contenant Amb, l-menthone et citronellol a été préparée dans du Tris – HCl 50 mM (pH 7, 5) avec ou sans diverses concentrations de pigOBP. La solution a ensuite été pipetée dans un flacon d'espace de tête de 2 mL (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis), scellé avec un septum à vis en polytétrafluoroéthylène (PTFE)/silicone, et chauffé pendant 5 min à 37 °C dans un bain d'eau. bain pour exposer la fibre SPME (polydiméthylsiloxane [PDMS]/divinylbenzène [DVB], df 65 μm, SUPELCO, Inc., Bellefonte, PA, USA) à l'espace de tête du flacon pendant 30 min. Les dispositifs SPME ont été conditionnés avant le prélèvement. Un chromatographe en phase gazeuse Agilent 7890A connecté à un détecteur sélectif de masse Agilent 5975C (Agilent Technologies) a été utilisé. La colonne analytique utilisée pour la GC/MS était une colonne DB-WAX pour les amines (60 m × 0,25 mm id, GL Sciences, Tokyo, Japon). L'hélium (99,99995%) a été utilisé comme gaz vecteur à un mode de pression constante (56,07 kPa). La température de l'injecteur (désorption) était de 250°C. La fibre SPME a été désorbée en mode sans crachat et le temps de désorption était de 1 min. Le programme de température du four variait de 40 °C (4 min) à 240 °C à 6 °C/min. L'ionisation électronique a été utilisée dans le MS avec une plage de balayage de 35 à 300 m/z. La température de la source d'ions a été maintenue à 230°C.

Une solution de mélange odorant (0,2 μL) contenant de l'Amb, de la Muscone et du PEA dissous dans de l'éthanol a été ajoutée à 20 μL de solution saline, de solution BSA, de mucus olfactif, de mucus OC dénaturé et de salive dans un flacon d'espace de tête de 2 mL (Agilent Technologies). Celui-ci a été immédiatement scellé avec un bouchon à vis septum en PTFE/silicone. Les odorants de l'espace de tête ont été analysés à l'aide de SPME GC/MS comme décrit précédemment. La colonne analytique GC/MS était une colonne VF-WAXms (30 m × 0,25 mm id, Agilent Technologies). La zone de pic du chromatogramme ionique extrait (EIC) des substances odorantes (m/z = 252 pour Amb, 238 pour Muscone et 91 pour PEA) a été ajustée en fonction de la zone de pic EIC de l'éthanol (m/z = 45) parmi les échantillons. Après extraction avec SPME, la solution aqueuse a été diluée avec de l'eau (80 μL) et de l'acétate d'éthyle (100 μL) a été ajouté. La solution a été vortexée pour extraire les odorants résiduels dans la couche organique. La couche organique a été analysée par GC/MS. L'échantillon injecté était de 1 μL en mode fractionné (10:1).

Les inhibiteurs de CES-1 (BNPP et benzil) et le CES-1 recombinant ont été achetés respectivement auprès de TCI (Tokyo, Japon) et de R&D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis). Pour les réactions enzymatiques, des mélanges odorants (0,2 μL, 10 mM dans de l'éthanol) ont été ajoutés à 20 μL de solution saline, de salive, de mucus INM, de mucus OC, d'échantillons dilués (avec solution saline) et de solutions CES-1 (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) avec ou sans inhibiteurs de CES-1 (solution aqueuse pour le BNPP et solution de diméthylsulfoxyde [DMSO] pour le benzile, 100 μM à concentration finale). La solution a été incubée à 37°C pendant 1 h, puis diluée avec 80 μL d'eau. De l'acétate d'éthyle (100 μL) a été ajouté à la solution : la solution biphasique a été vortexée pour extraire les odorants et les métabolites. La couche organique a été collectée et analysée en utilisant GC/MS comme décrit précédemment. Les concentrations ont été déterminées en utilisant la surface du pic EIC. Dans l'analyse des relations structure-activité avec divers acétates, la surface du pic de l'ester 19 est restée presque inchangée d'une expérience à l'autre et l'alcool correspondant n'a pas été détecté. Par conséquent, la surface de pic parmi les expériences a été ajustée en utilisant la surface de pic.

Pour déterminer l'évolution temporelle de la réaction enzymatique de pCA, 1,6 μL de pCA (10 mM dans de l'éthanol) ont été ajoutés à 160 μL de mucus OC dilué × 10, de solution CES-1 (0,57 μg/mL) et de véhicules. Ensuite, 20 μL de la solution réactionnelle ont été collectés à 0, 1, 5, 10, 20, 40, 60 et 120 min après l'ajout de pCA, incubés à 37 ℃ et soumis à GC/MS. Pour déterminer la valeur de Michaelis – Menten, du pCA a été ajouté à la solution diluée de mucus OC ou de CES-1, à des concentrations finales de 50, 100, 250, 500 et 1000 μM. Les solutions de réaction ont été incubées à 37 ℃ pendant 5 min (mucus OC dilué) ou 40 min (solution CES-1), et les vitesses de réaction ont été déterminées par analyse GC/MS. Les valeurs Michaelis – Menten Vmax et Km ont été calculées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). pCA (concentration finale = 100 μM) a été utilisé pour déterminer la réactivité enzymatique d'échantillons de mucus OC individuels (temps d'incubation = 5 min).

Le pCA a été préparé sous la forme d'une solution d'huile minérale à 0,1 %. La concentration en p-crésol était de 0,001 % dans l'eau distillée. Les solutions odorantes (1 ml) ont été placées dans des flacons en verre de 110 ml. Muscone a été directement appliqué sur des boules de coton stérilisées (1,0 mg) dans un flacon. Les flacons ont été laissés ouverts pour équilibrer l'espace de tête. Le nombre de participants avec le génotype OR9Q2 n'a pas été déterminé, car aucune variante faux-sens n'a été signalée. On a demandé à huit participants de sentir le p-crésol, et l'intensité perçue de l'odeur a été enregistrée sur une échelle de 95 mm, allant de l'absence d'odeur à l'odeur forte. On leur a ensuite donné un échantillon (eau, p-crésol, muscone ou pCA) et on leur a demandé d'inhaler pendant 2 min. Le p-crésol a été présenté à nouveau dans un flacon différent, et les participants ont été invités à évaluer à nouveau l'intensité perçue de l'odeur. Le changement d'intensité a été calculé comme suit : avant la désensibilisation, les valeurs ont été normalisées à 100 %, puis comparées aux valeurs après la désensibilisation. Le classement était soit une valeur positive (augmentation de l'intensité du p-crésol après désensibilisation) soit une valeur négative (diminution de l'intensité du p-crésol après désensibilisation) jusqu'à un minimum de -100 (pas d'odeur perçue après désensibilisation). Dans chaque test, deux essais distincts avec le même odorant ont été présentés comme échantillon A. Les classements des participants du p-crésol présentés à des moments différents ont été comparés pour déterminer la fiabilité. Si la différence entre les classements était > 30 %, l'évaluation était jugée non fiable et les classements d'intensité étaient arbitrairement attribués. Les résultats ont ensuite été exclus de l'analyse. Les participants ont eu une pause de 10 minutes entre chaque essai pour inverser les effets de la désensibilisation.

Le test de luciférase Dual-Glo™ (Promega, Madison, WI, USA) a été réalisé comme décrit précédemment55. En bref, FLAG-Rho-tagged OR, cAMP response element (CRE)/luc2PpGL4.29, pRL-CMV et RTP1S ont été ajoutés au milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec de la polyéthylèneimine Max (PEI-MAX, Polysciences, Warrington, PA, USA) pour chaque puits d'une plaque à 96 puits recouverte de poly-d-lysine (Corning) ou d'une plaque à 384 puits recouverte de poly-d-lysine (Corning). Après 15 min d'incubation, la suspension cellulaire a été ajoutée à la solution de transfection. Après 24 h de transfection, le milieu a été retiré et les cellules transfectées ont été stimulées avec une solution odorante diluée dans du DMEM. les activités des gènes rapporteurs ont été mesurées. L'activité induite par l'odorant a été calculée comme le rapport CRE: luc (intensité de luminescence de la luciférase de luciole divisée par celle de la luciférase de Renilla) ou le facteur d'augmentation (Luc(N) divisé par Luc(0)). Luc(N) était le rapport CRE:luc d'un puits spécifique stimulé par une odeur, et Luc(0) était le rapport CRE:luc d'un puits spécifique non stimulé. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel Microsoft Excel ou GraphPad Prism.

L'expérience a été menée comme décrit précédemment65. Les cellules ont été ensemencées sur des boîtes à fond de verre de 35 mm (Iwaki Inc., Chiba, Japon) recouvertes de poly-d-lysine. Ensuite, les cellules ont été transfectées avec Rho-OR9Q2, Gα15 et RTP1S avec PEI-MAX. Après 24 h d'incubation, les cellules chargées de Fura-2/AM ont ensuite été lavées avec une solution de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 3 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, glucose 10 mM et HEPES 10 mM [pH 7,4]) et soumis à une imagerie calcique. Une série d'odorants dans la solution de Ringer ont été appliqués séquentiellement sur les cellules à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 2,0 ml/min. Les niveaux intracellulaires de Ca2+ ont été détectés sous forme de fluorescence Fura-2/AM à 510 nm par excitation à 340 ou 380 nm à l'aide d'AQUA COSMOS (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japon).

Le système de dosage GloSensor™ cAMP (Promega, Madison, WI, USA) a évalué l'effet d'un volume moyen sur les réponses OR en temps réel à la phase vapeur des odorants (Amb ou p-crésol). Les cellules HEK293T ont été transfectées avec 30 ng/puits de plasmide RTP1S, 67,5 ng/puits de plasmide OR9Q2 ou 30 ng/puits de plasmide cOR5A2 et 67,5 ng/puits de plasmide 20F (Promega) sur une plaque noire à 96 puits (Corning, Glendale, AZ , ETATS-UNIS). 24 à 40 h après la transfection, le DMEM (Thermo Fisher Scientific) a été remplacé par 50 μL de milieu indépendant du CO2 (Thermo Fisher Scientific) contenant 4 % de réactif GloSensor cAMP (Promega). Après 2h d'équilibration à 37°C, le volume du milieu a été ajusté de 0 à 50 μL par paliers de 10 μL. Immédiatement après, une boule de coton de 7 mm (Osaki Medical, Nagoya, Japon) a été placée au-dessus du milieu dans chaque puits. La plaque a été chargée dans un système de criblage de médicaments fonctionnel (FDSS)/µCELL (HAMAMATSU Photonics, Shizuoka, Japon). Après 20 min d'équilibrage à 37 ℃, 150 μL de solution aqueuse odorante ont été automatiquement appliqués sur chaque boule de coton à 50 μL/s. La luminescence cellulaire a été mesurée à des intervalles de 5 s pendant 60 min. À chaque instant, une valeur de luminescence brute provenant de cellules stimulées par une odeur a été soustraite par une valeur provenant de cellules non stimulées. Le rapport de la valeur soustraite individuelle à la valeur maximale dans la condition de 50 μL a été défini comme la réponse normalisée (%).

Les dosages d'influx de calcium ont été effectués à l'aide d'un FDSS/µCELL. Les cellules dans lesquelles TRPM8 était exprimé de manière stable ont été obtenues, comme décrit précédemment66. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits revêtues de poly d-lysine (Corning) à 20 000 cellules/puits et cultivées pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été incubées avec une solution de Ringer, additionnée de Fluo4-AM 2 µM, de probénécide 0, 5 mM et de Pluronic F-127 à 0, 01%, à 37 ° C pendant 1 h. Les cellules ont été lavées une fois et récupérées avec le tampon de dosage. Par la suite, les plaques ont été insérées dans le FDSS et les cellules et les échantillons de test ont été préincubés pendant 5 min. Le tampon de test a été préchauffé à 37 ° C et le test a été effectué à 30 ° C dans le FDSS. Les réponses [Ca2+]i maximales ont été mesurées sous la forme du rapport d'intensité de fluorescence maximale (intensité de fluorescence maximale/intensité de fluorescence basale) et exprimées en pourcentages de la réponse à 4 μM d'ionomycine.

Toutes les données discutées dans le document sont disponibles dans le manuscrit ou dans l'annexe SI.

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Nous remercions Madelyn Abraham pour avoir établi une méthode d'évaluation de l'adaptation des odeurs chez les participants, Mari Kobayashi pour avoir généré les plasmides des OR et les membres de l'hôpital Edogawa pour la collecte de mucus.

Junkichi Yokoyama

Adresse actuelle : Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Nadogaya Hospital, 2-1-1 Shinkashiwa, Kashiwa, Chiba, Japon

Recherche en sciences sensorielles, Kao Corporation, 2606 Akabane, Ichikai-machi, Haga, Tochigi, Japon

Tomohiro Shirai, Dan Takase, Chisaki Uehara, Naoko Saito, Aya Kato-Namba et Keiichi Yoshikawa

Recherche en sciences analytiques, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, Japon

Kuniyuki Nakanishi

Département d'oto-rhino-laryngologie-chirurgie de la tête et du cou, hôpital d'Edogawa, 2-24-18 Higashikoiwa, Edogawa, Tokyo, Japon

Junkichi Yokoyama

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TS, conceptualisation, méthodologie, validation, analyse formelle, enquête, conservation des données, rédaction - préparation du projet original, rédaction - révision et édition et administration de projet ; DT, méthodologie, enquête et rédaction—préparation de l'ébauche originale ; JY, enquête et supervision ; KN, enquête ; UC, enquête ; NS, enquête et supervision ; AK-N., enquête ; KY, conceptualisation, méthodologie, validation, analyse formelle, enquête, rédaction—préparation du projet original, rédaction—révision et édition, visualisation.

Correspondance à Keiichi Yoshikawa.

Les auteurs, à l'exception de JY, sont des employés de Kao Corporation. Kao Corporation détient un brevet (P6588715) lié aux récepteurs olfactifs humains pour le p-crésol et a demandé des brevets liés à des méthodes d'administration d'eau dans le mucus nasal et de stimulation par la vapeur des RO. Il n'y a aucun produit actuellement en développement ou commercialisé à déclarer. Ce travail a été soutenu par Kao Corporation, qui a fourni des salaires aux auteurs. Le bailleur de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Réimpressions et autorisations

Shirai, T., Takase, D., Yokoyama, J. et al. Fonctions du mucus olfactif humain et changements liés à l'âge. Sci Rep 13, 971 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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Reçu : 10 novembre 2022

Accepté : 10 janvier 2023

Publié: 18 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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