Effet antiviral du chlorure de cétylpyridinium en rince-bouche sur le SRAS

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 14050 (2022) Citer cet article

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Le chlorure de cétylpyridinium (CPC), un composé d'ammonium quaternaire, présent dans les bains de bouche, est efficace contre les bactéries, les champignons et les virus enveloppés. Cette étude a été menée pour explorer l'effet antiviral du CPC sur le SRAS-CoV-2. Il existe peu de rapports sur l'effet du CPC contre le SARS-CoV-2 de type sauvage à de faibles concentrations telles que 0,001 % à 0,005 % (10 à 50 µg/mL). Fait intéressant, nous avons constaté que de faibles concentrations de CPC supprimaient l'infectivité des souches humaines isolées du SARS-CoV-2 (Wuhan, Alpha, Beta et Gamma) même dans la salive. De plus, nous avons démontré que le CPC montre des effets anti-SARS-CoV-2 sans perturber l'enveloppe du virus, en utilisant l'analyse de la densité du saccharose et l'examen au microscope électronique. En conclusion, cette étude a fourni des preuves expérimentales que le CPC peut inhiber l'infection par le SRAS-CoV-2 même à des concentrations plus faibles.

Selon les informations récentes du centre de ressources sur les coronavirus de l'Université de médecine Johns Hopkins1, le COVID-19 est responsable de plus de 420 millions de cas et d'environ 6 millions de décès dans le monde.

Le SRAS-CoV-2 a été initialement signalé à Wuhan, en Chine2 et certaines variantes d'intérêt et variantes préoccupantes (COV) ont également été signalées3. En outre, il craint que certaines variantes telles que Delta et Omicron aient la capacité d'échapper à l'immunité induite par le vaccin4,5,6. Par conséquent, les scientifiques craignent que la pandémie de SRAS-CoV-2 ne se poursuive même après l'augmentation de la couverture vaccinale.

Il a été rapporté que le SRAS-CoV-2 infecte les cellules épithéliales de la muqueuse buccale et des glandes salivaires, qui expriment les facteurs d'entrée viraux, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) et les membres de la protéase transmembranaire sérine (TMPRSS)7. Ainsi, de cette manière, la cavité buccale joue un rôle crucial dans l'infection et la transmission du SRAS-CoV-2. Bien que le symptôme de COVID-19 lié à la cavité buccale soit la dysgueusie et la stomatite8,9, de nombreuses personnes infectées par le SRAS-CoV-2 pourraient être asymptomatiques, entraînant sa transmission à d'autres personnes.

Le SRAS-CoV-2 peut se répliquer dans la cavité buccale et se libérer dans la salive7. De plus, le SRAS-CoV-2 peut se répliquer dans l'épithélium respiratoire10 et peut être transmis à la cavité buccale par la toux. La transmission du SRAS-CoV-2 par des gouttelettes et/ou des aérosols provoque son infection et sa réplication dans les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires, entraînant des lésions alvéolaires11. De plus, il est rapporté que la transmission du SRAS-CoV-2 se produit par des gouttelettes provenant d'activités expiratoires, telles que parler, tousser et éternuer12,13. Fait intéressant, les personnes infectées par le SRAS-CoV-2 peuvent devenir une source de transmission même pendant la période d'incubation asymptomatique du virus14. Ainsi, nous devons étudier la stratégie de prophylaxie contre COVID-19. De plus, la relation entre l'aspiration de gouttelettes de salive contenant le SRAS-CoV-2 et l'aggravation du COVID-19 a été rapportée15. Par conséquent, les soins bucco-dentaires sont importants pour la prévention de la transmission du SRAS-CoV-2.

Le rince-bouche s'est concentré sur la prévention de l'infection du microbiome16. De plus, plusieurs composants du rince-bouche ont récemment été signalés comme réduisant les virions du SRAS-CoV-2 dans la cavité buccale17,18. Le chlorure de cétylpyridinium (CPC) est largement utilisé comme l'un des composants bactéricides des bains de bouche, des comprimés, des sprays et des gouttes. Le CPC peut perturber la membrane lipidique par des interactions physico-chimiques. Le CPC a déjà été signalé comme ayant des effets bactéricides ainsi que des effets antiviraux contre le virus de la grippe19 et les coronavirus20,21,22. Comparé à d'autres ingrédients dans les bains de bouche, y compris la povidone iodée et la chlorhexidine (CHX); Le CPC est insipide, inodore et convient donc aux applications dans les produits de soins bucco-dentaires. À ce jour, il existe peu de rapports décrivant l'activité virucide du CPC contre le SRAS-CoV-2. Seneviratne et al. ont rapporté que le CPC réduisait la charge virale du SRAS-CoV-2 dans la salive de quatre patients atteints de COVID-1923 par rapport à l'eau témoin, mais l'infectiosité virale dans la salive n'était pas décrite. Un rapport récent a montré l'effet du CPC à une concentration bien inférieure à celle du CPC dans les bains de bouche disponibles dans le commerce contre le pseudovirus24. Mais il n'y a aucun rapport sur l'effet du CPC à de faibles concentrations telles que 0,001 % à 0,005 % (10 à 50 µg/mL) contre le SRAS-CoV-2 de type sauvage dans la salive. Au Japon, la concentration de CPC dans les bains de bouche disponibles dans le commerce est de près de 30 à 50 µg/mL, ce qui est bien inférieur à celui des bains de bouche utilisés dans les rapports précédents24,25. Par conséquent, nous avons examiné les effets antiviraux du CPC sur le SRAS-CoV-2 à de faibles concentrations. En outre, nous avons également examiné le mécanisme de l'activité anti-SARS-CoV-2 du CPC par analyse de la densité du saccharose et observation au microscope électronique.

Nous avons examiné les souches SARS-CoV-2, y compris Wuhan, Alpha, Beta et Gamma, qui appartiennent aux COV. Le test de plaque a démontré que le CPC supprimait de manière significative l'infectivité de tous les SARS-CoV-2 examinés directement de manière dose-dépendante (Figs. 1a–d, S1). Le traitement au CPC (50 μg/mL) a complètement inactivé la souche SARS-CoV-2 Wuhan de la même manière que le Triton X-100 (1 %) (Fig. 1e). Un rince-bouche commercial (gargarisme médical SP-T : SP-T) contenant la même concentration de CPC a montré un meilleur effet antiviral que la solution de CPC sans ingrédients interférents. Le titre viral du SRAS-CoV-2 traité avec SP-T était inférieur à la limite de détection de 2,0 × 103 PFU/mL (Fig. S2). Ces résultats ont indiqué que les concentrations plus faibles de CPC (10 à 40 μg/mL) que celles des bains de bouche disponibles dans le commerce (50 μg/mL) présentaient des effets anti-SARS-CoV-2 dans de nombreuses souches, y compris les COV.

Efficacité antivirale du CPC contre le SRAS-CoV-2 par dosage sur plaque à l'aide de cellules Vero E6 exprimant le gène TMPRSS2 (VeroE6/TMPRSS2). Les titres de virus ont été comptés et le titre de virus des souches SARS-CoV-2 Wuhan (a), Alpha (b), Beta (c) et Gamma (d) traitées par CPC (0–40 μg/mL) à température ambiante pendant 30 min ont été quantifiés et représentés en PFU/mL. Le test de plaque a également été effectué en présence de PBS, de CPC (50 μg/mL) ou de Triton X-100 (1 %) pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été filtrés par des colonnes PD-10 pour éliminer les réactifs (e). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle. (*p < 0,05).

Ensuite, nous avons évalué l'effet du CPC sur l'entrée cellulaire du SRAS-CoV-2. Les cellules VeroE6/TMPRSS2 ont été infectées par la souche Wuhan SARS-CoV-2 traitée par CPC à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01. Le niveau d'expression de l'ARN viral dans les cellules a été significativement réduit par le CPC de manière dose-dépendante 24 h après l'infection (Fig. 2). Le nombre de copies d'ARN viral a été réduit à environ un trentième par CPC à la concentration de 15 μg/mL par rapport au contrôle. Ces données ont indiqué que les quantités de virions infectieux ont été diminuées par le CPC avant l'entrée des cellules. Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant du CPC à la concentration qui n'a pas provoqué de cytotoxicité (Fig. S3).

Efficacité antivirale du CPC contre le SRAS-CoV-2 par qRT-PCR. Des cellules VeroE6/TMPRSS2 ont été inoculées avec la souche SARS-CoV-2 Wuhan à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 après avoir mélangé une quantité égale de CPC. À 24 h après l'infection, les niveaux relatifs d'ARN de la protéine virale N ont été évalués quantitativement par qRT-PCR. (*p < 0,05).

Pour déterminer si le CPC est efficace sur le SRAS-CoV-2 dans la salive qui contient de nombreuses protéines et est très visqueuse, nous avons mesuré l'infectivité de la souche SARS-CoV-2 Wuhan par dosage de plaque après incubation avec du CPC dans la salive prélevée sur des volontaires sains. Le test de plaque a démontré l'effet inhibiteur du CPC (25–40 μg/mL) contre le SRAS-CoV-2 dans la salive de manière significative et dose-dépendante (Fig. 3).

Efficacité antivirale du CPC contre le SRAS-CoV-2 avec la salive par dosage de plaque en utilisant des cellules Vero E6 exprimant le gène TMPRSS2 (VeroE6/TMPRSS2). La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été ajoutée dans la salive et mélangée avec une quantité égale de CPC. (*p < 0,05).

Pour analyser le mécanisme du CPC sur l'infectivité du SRAS-CoV-2, nous avons effectué une analyse de la densité de saccharose des virions du SRAS-CoV-2 traités soit par 1 × solution saline tamponnée au phosphate (PBS), CPC (50 μg/mL) ou Triton X- 100 (1%) pendant 10 min à température ambiante (Fig. 4a). Les protéines SARS-CoV-2 S et N ont montré une distribution spécifique tout au long du gradient. Le décalage de bande a été observé dans les virions traités avec Triton X-100 ; cependant, les fractions étaient différentes de celles traitées avec du PBS ou du CPC. En d'autres termes, le PBS et le CPC pourraient n'avoir aucun effet sur la structure des virions du SRAS-CoV-2, alors que le Triton X-100 a modifié la structure. De plus, la morphologie des virions a été analysée par microscopie électronique à transmission (MET). L'analyse au microscope électronique a révélé que la structure des particules sphériques du SRAS-CoV-2 traité avec du PBS restait inchangée. Nous avons également constaté que la plupart des particules virales traitées avec 10 µg/mL de CPC restaient inchangées, tandis que certaines se désintégraient avec 50 µg/mL de CPC. En revanche, presque toutes les particules virales traitées avec 250 µg/mL de CPC ont été clairement perturbées (comme 1 % de Triton X-100). La quantité de 50 µg/mL était considérée comme une concentration à laquelle toutes les particules virales ne se brisaient pas. Ce résultat est cohérent avec les données d'analyse de la densité du saccharose (Fig. 4b).

Analyse de la densité du saccharose et analyse TEM des particules de SARS-CoV-2. ( a ) Analyse de la densité de saccharose de l'assemblage de la capside en présence de 1 × PBS, CPC (50 μg/mL) et Triton X-100 (1 %). La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été traitée avec les régents décrits pendant 10 min, et les virions traités ont été appliqués à l'ultracentrifugation à gradient de densité. Chaque fraction a été appliquée à SDS-PAGE et analysée par Western blot avec des anticorps contre la protéine S et la protéine N. (b) Micrographies électroniques des virions du SRAS-CoV-2 après traitement avec des réactifs. La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été traitée avec 1 × PBS, CPC (10, 50, 250 μg/mL) et Triton X-100 (1 %) pendant 10 min à température ambiante. Chaque barre d'échelle représente 50 nm.

Dans cette recherche, nous avons démontré que le CPC à faible concentration de 50 μg/mL ou moins, supprime l'infectiosité de la souche SARS-CoV-2 Wuhan et des COV, y compris les souches Alpha, Beta et Gamma. Le CPC a montré des effets virucides contre le SARS-CoV-2 même dans la salive. Ainsi, nous avons constaté que de faibles concentrations de CPC exerçaient une activité antivirale suffisante contre le SRAS-CoV-2. Étant donné que le CPC perturbe les bicouches lipidiques, des concentrations élevées de CPC peuvent exercer des effets cytotoxiques. Par conséquent, le CPC peut être appliqué dans une formulation qui peut exercer son effet pendant longtemps à de faibles concentrations. Étant donné que la formulation du prototype de rince-bouche peut contenir d'autres ingrédients interférents pour éteindre les faibles niveaux de CPC utilisés dans les expériences, nous avons testé un rince-bouche commercial avec la même concentration de CPC, qui a montré le même effet antiviral ou meilleur que la solution CPC sans ingrédients interférents ( figure S2). De plus, nous pourrions suggérer que l'effet antiviral pourrait ne pas être dû à la destruction de la membrane lipidique mais à la dénaturation de la protéine SARS-CoV-2.

Il a été rapporté que le CPC est efficace contre la variante alpha du SRAS-CoV-224. Notre étude a révélé que le CPC atténue l'infectivité de deux autres variantes (souches bêta et gamma) à de faibles concentrations. Le traitement au CPC pendant 1 h n'a pas montré de cytotoxicité pour VeroE6 / TMPRSS2 jusqu'à 40 μg / ml (Fig. S3). De plus, dans des études antérieures, un rince-bouche contenant une concentration plus élevée de CPC a été utilisé (500–750 μg/mL)24,25. A ces concentrations, on considère que la membrane lipidique des cellules peut être endommagée.

La durée de l'effet antiviral du rince-bouche contenant du CPC n'est pas encore claire ; cependant, nos résultats suggèrent qu'une concentration plus faible est suffisante pour montrer un effet antiviral. En tant que limitation de cette expérience, lorsque le CPC est appliqué comme bain de bouche, la durée d'action est supposée être inférieure à une minute. Cependant, compte tenu de la complexité de la technique expérimentale et de la possibilité d'erreurs dans la durée d'action parmi les échantillons, la durée minimale d'action a été fixée à 10 min dans notre étude. À cet égard, Anderson et al. ont clarifié l'effet du CPC à un temps d'action de 30 s en utilisant une méthode de neutralisation du CPC26. Ainsi, il est justifié de développer de nouveaux produits, tels que des comprimés, des gouttes et des patchs qui peuvent libérer du CPC à une concentration sûre et peuvent être conservés dans la cavité buccale aussi longtemps que possible.

Nous avons montré que le CPC supprimait l'infectivité du SRAS-CoV-2 dans la salive visqueuse, qui contient diverses protéines. Cependant, il semble que l'effet soit affaibli dans la salive par rapport au PBS. Cela peut être dû à la présence de protéines salivaires chargées négativement, à une efficacité de diffusion réduite due à la viscosité et à la formation de micelles27. Cependant, même de faibles concentrations de CPC ont montré une suppression suffisante de l'infectivité du SRAS-CoV-2. Les effets suppressifs de faibles concentrations de CPC sur l'infectiosité du SRAS-CoV-2 dans la salive des patients COVID-19 réels restent à élucider.

On pense que le mécanisme d'action qui supprime l'infectiosité du SRAS-CoV-2 est dû à la destruction de l'enveloppe virale. Cette étude a montré que le CPC inactive le SRAS-CoV-2 sans perturber la particule virale à la concentration et à la durée des expériences. Il a été rapporté qu'une concentration élevée (250 à 500 μg/mL) de CPC perturbe l'enveloppe du SARS-CoV-222,28. Ainsi, le degré de dégradation morphologique dépendant de la concentration de CPC varie. Autrement dit, les particules sont froissées, mais pas éclatées, à une concentration encore suffisante pour désactiver le virus. Ces résultats sont cohérents avec les résultats de l'analyse du gradient de densité de saccharose. De plus, pour les raisons ci-dessus, le mécanisme antiviral du CPC mis en évidence par notre étude appuie la découverte selon laquelle le CPC interfère principalement avec la membrane lipidique29. La figure 4b montre des particules virales de différentes tailles. Dans les rapports précédents, le diamètre du SRAS-CoV-2 variait d'environ 60 à 140 nm, ce qui est cohérent avec les résultats actuels2,5,30. Cependant, le mécanisme détaillé d'inactivation du SRAS-CoV-2 par une concentration plus faible de CPC n'est toujours pas clair. Nos résultats suggèrent que l'effet dénaturant de la protéine S peut être impliqué dans l'entrée, et il semble jouer un rôle crucial.

On pense que l'entrée des virus dans l'organisme se fait par la cavité buccale et la cavité nasale31. En appliquant des sprays nasaux contenant du CPC et en réduisant la quantité de virus dans la cavité nasale, cela peut conduire au contrôle de l'infection au COVID-19. Cependant, à ce jour, il n'existe aucun rapport montrant l'utilisation de sprays nasaux CPC et l'effet préventif de ceux-ci est encore inconnu.

Actuellement, nous menons une étude clinique pour examiner l'effet du CPC chez les patients COVID-19, qui traite de l'effet du CPC sur la charge virale du SRAS-CoV-2 dans la salive du patient. Une faible charge virale dans la salive pourrait entraîner un faible taux de transmission et une progression moindre de l'état de la maladie.

L'utilisation de produits contenant du CPC peut entraîner une réduction du nombre de patients covid nouvellement infectés. De plus, cela peut être un moyen de mesures préventives dans les pays mal vaccinés. Nous prévoyons que le CPC sera utilisé comme l'un des outils pour prévenir l'apparition et l'infection du SRAS-CoV-2.

Les cellules Vero E6 (ATCC, Manassas, VA, USA) ont été maintenues dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (v/v) et incubées à 37 °C avec 5 % de CO2. Des cellules Vero E6 exprimant de manière stable TMPRSS2 humain (VeroE6/TMPRSS2)32 ont également été utilisées pour cette étude.

Les souches SARS-CoV-2 Wuhan (WK-521 ; EPI_ISL_408667), Alpha (QK002 ; EPI_ISL_768526), Beta (TY8-612 ; EPI_ISL_1123289) et Gamma (TY7-501 ; EPI_ISL_833366) ont été aimablement fournies par le Dr Saijo (National Institut des maladies infectieuses, Tokyo, Japon). Ces virus ont été préparés en utilisant des cellules VeroE6/TMPRSS2. Toutes les expériences utilisant le SRAS-CoV-2 ont été réalisées dans l'installation de niveau de sécurité biologique 3 (BSL-3) de l'Institut international de contrôle des zoonoses (numéro approuvé : 19(19), #21002-3), Université d'Hokkaido et ont suivi la norme procédures d'exploitation de BSL-3. De plus, toutes les conceptions expérimentales utilisant des agents pathogènes ont été approuvées par l'École supérieure de médecine dentaire de l'Université d'Hokkaido (numéro d'approbation : R-2-4-1).

Le CPC (TCI, Tokyo, Japon) a été dissous avec de l'eau distillée déionisée (DDW) et stérilisé par un filtre (0,45 µm de diamètre) (Sartorius, Göttingen, Allemagne). De plus, Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), un tensioactif, a été utilisé comme contrôle positif. Le PBS a été utilisé comme contrôle négatif.

La salive a été fournie par cinq volontaires sains non vaccinés. Tous les échantillons de salive ont été déterminés comme étant négatifs pour le SRAS-CoV-2 par réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR) avant les expériences et mélangés dans un tube. Cette expérience a été approuvée par le comité d'éthique institutionnelle de l'Université d'Hokkaido pour utiliser des matériaux d'origine humaine. Le consentement éclairé a été obtenu de chaque volontaire avant de collecter la salive (numéro approuvé : 2021-2).

La viabilité cellulaire de VeroE6/TMPRSS2 a été mesurée par un test MTS [3-(4,5-dimethylthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] utilisant CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega, Madison, WI, USA) en présence de différentes concentrations de CPC (0–50 µg/mL) pendant 1 h à 37 °C. L'absorbance a été mesurée avec GloMax Multiplus Plate Reader/Luminometer (Promega). Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triple.

Les souches de SRAS-CoV-2 ont été mélangées avec une quantité égale de solution de CPC (concentration finale : 0 à 50 µg/mL avec DMEM contenant 2 % de FBS) ou de gargarisme médical SP-T (Lion Corporation, Tokyo, Japon), qui a été dilué dans du PBS à une concentration de 50 µg/mL, similaire au CPC. Le mélange a été incubé pendant 30 min à température ambiante et dilué au 1/10 avec 2 % de FBS DMEM pour réduire le CPC dans le mélange. Le mélange dilué a été inoculé dans des cellules VeroE6/TMPRSS2 et incubé à 37 °C pendant 1 h avec rotation. Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS 1 × pour éliminer le CPC, puis recouvertes de 2% de FBS DMEM contenant 1, 2% de Bacto Agar (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Après 48 h d'incubation à 37 °C, les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde tamponné à 3,7 % pendant une nuit. Les cellules fixées ont été colorées avec 1 % de cristal violet. Les cellules infectées par le SRAS-CoV-2 ont démontré des effets cytopathiques, et les amas de cellules infectées peuvent être vus comme des zones non colorées, telles que des plaques.

Les cellules VeroE6/TMPRSS2 ont été ensemencées sur des plaques à 24 puits à une densité de 1,0 × 105 cellules/puits. La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été mélangée avec une quantité égale de CPC (concentration finale : 0–25 μg/mL). À chaque concentration de médicament, les puits ont été infectés avec 1,0 × 103 PFU (MOI = 0,01) de virus. Les mélanges ont été incubés pendant 30 min à température ambiante. Après incubation, les mélanges ont été inoculés dans des cellules VeroE6/TMPRSS2 et incubés à 37 °C pendant 1 h avec rotation. Après 1 h d'absorption, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS 1 × pour éliminer le CPC et cultivées dans un milieu de maintenance. 24 h après l'infection (hpi), les ARN totaux ont été extraits des cellules inoculées à l'aide du réactif TRIzol ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et l'ARN total a été extrait avec le kit RNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, Allemagne). Les ARN extraits ont été soumis à une analyse qRT-PCR avec le kit THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR (TOYOBO, Osaka, Japon). Le génome du SRAS-CoV-2 a été quantifié à l'aide d'ensembles de sondes d'amorces pour N2 (Takara, Shiga, Japon). La β-actine de primate non humain a été utilisée comme contrôle endogène. Les séquences d'amorce et de sonde pour la β-actine de primate non humain ont été décrites précédemment33. Les niveaux du gène N du SRAS-CoV-2 ont été normalisés avec celui de l'ARNm de la β-actine34. De plus, les niveaux d'ARN viral à 24 hpi ont été normalisés avec les niveaux d'ARN viral à 0 hpi. Tous les tests RT-PCR ont été effectués à l'aide du système de PCR en temps réel CFX96 (BioRad, Hercules, CA, USA). Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triple.

La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été ajoutée dans la salive prélevée sur un volontaire sain et mélangée avec une quantité égale de CPC (concentration finale : 0–40 μg/mL). Les mélanges de salive ont été dilués au 1/100 pour réduire la viscosité et filtrés à travers des filtres de 0,45 μm (Sartorius) pour éliminer les bactéries et les champignons. Le test de plaque a été effectué comme décrit précédemment (section "Test de plaque"). Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triple.

La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été traitée avec du CPC (50 μg/mL) ou du Triton X-100 (1 %) à température ambiante pendant 10 min. Après incubation, les mélanges ont été chargés sur des gradients de densité de saccharose de 10 % à 50 %. Après ultracentrifugation avec Optima XE-90 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) pendant 6 h à 250 000 × g, chaque 100 μL de gradients a été fractionné en 22 fractions et mélangé avec 100 μL de tampon d'échantillon SDS-PAGE et bouilli à 95 °C pendant 5 min. Après ébullition, ils ont été analysés par SDS-PAGE à 10% suivi d'une analyse par immunotransfert à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-SARS-CoV-2 S protein (GTX632604) ou d'un anticorps polyclonal N protein (GTX135357) de lapin (GeneTex, Irvine, CA, USA). Les membranes ont été coupées à 100 kDa après le transfert et hybridées avec l'anticorps de la protéine S et avec l'anticorps de la protéine N respectivement et soumises à une visualisation. Un ImageQuant LAS 4000 mini (FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japon) a été utilisé pour l'imagerie (Fig. S4).

La souche SARS-CoV-2 Wuhan a été traitée avec 1 × PBS, CPC (10, 50 et 250 μg/mL) et Triton X-100 (1 %) pendant 10 min à température ambiante. Les mélanges ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 2,5 % à 4 °C pendant 24 h. L'échantillon fixe (5 μL) a été placé sur une feuille de Parafilm. Formvar Film (#10-1009, Okenshoji, Tokyo, Japon) a été placé sur chaque goutte pour adsorber le virus pendant 5 min. Les grilles ont été lavées avec du DDW et placées sur une goutte de solution d'acétate d'uranyle à 2,0% filtrée pendant 1 min supplémentaire, séchées à l'air et examinées à l'aide d'un JEM-1400 TEM (JEOL, Tokyo, Japon) à 80 kV.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Graphpad Prism v9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET des triplicats biologiques. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle. Pour tous les ensembles de données, une valeur p inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le Comité d'éthique institutionnelle de l'Université d'Hokkaido (numéro approuvé : 2021-2).

Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l'étude.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier Enago (www.enago.jp) pour la révision en anglais. Ce travail a été soutenu par JST SPRING, Grant Number JPMJSP2119. Nous sommes reconnaissants aux bénévoles qui ont fait don de leur salive avec le consentement des participants. Nous remercions tous les membres de l'Institut international de recherche sur les zoonoses pour leurs commentaires et suggestions utiles.

Biologie vasculaire et pathologie moléculaire, Faculté de médecine dentaire et École supérieure de médecine dentaire, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Ryo Takeda, Nako Maishi, Takuya Tsumita et Kyoko Hida

Diagnostic oral et médecine, Faculté de médecine dentaire et École supérieure de médecine dentaire, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Ryo Takeda et Yoshimasa Kitagawa

Division de pathobiologie moléculaire, Institut international de lutte contre les zoonoses, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki et Yasuko Orba

Unité de collaboration internationale, Institut international de lutte contre les zoonoses, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Hirofumi Sawa et Yasuko Orba

One Health Research Center, Hokkaido University, Sapporo, Japon

Hirofumi Sawa

Section de soutien à l'éducation et à la recherche, École supérieure de médecine dentaire, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Natsumi Ushijima

Community Service and Welfare Network, Hokkaido University Hospital, Sapporo, Japon

Yasuhiro Hida

Dentisterie restauratrice, Faculté de médecine dentaire et École supérieure de médecine dentaire, Université d'Hokkaido, Sapporo, Japon

Hidehiko Sano

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Conceptualisation, KH, HS, YK et HS ; méthodologie, MS et HS ; Analyse formelle, enquête, conservation et visualisation des données, RT, MS et NU ; Interprétation des données, NM et TT ; Rédaction—Préparation du brouillon original, RT ; Rédaction—Revue et édition, HS, YO, YH et KH ; Supervision, HS et KH ; Administration du projet, HS et KH ; Acquisition de financement, RT et KH Tous les auteurs ont lu et accepté la version soumise du manuscrit.

Correspondance à Kyoko Hida.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Takeda, R., Sawa, H., Sasaki, M. et al. Effet antiviral du chlorure de cétylpyridinium en rince-bouche sur le SRAS-CoV-2. Sci Rep 12, 14050 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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Reçu : 18 mars 2022

Accepté : 10 août 2022

Publié: 18 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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